人工栽培黄花石蒜乙醇提取物HPLC指纹图谱研究

王姣 刘霞 刘湘丹 周日宝

【摘 要】 目的：建立人工栽培黄花石蒜乙醇提取物HPLC指纹图谱。方法：黄花石蒜乙醇提取物的分析采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）;流动相：甲醇（A）-水（含0.1%磷酸，B），梯度洗脱见表2;柱温：30℃;紫外检测波长：238nm;流速：1.0mL/min。结果：以加兰他敏为参照峰，确定了13个特征峰，10批样品指纹图谱相似度均在0.9以上。結论：此方法操作简单，准确可靠，可为黄花石蒜鉴别及内在质量评价提供参考依据。

【关键词】 黄花石蒜;花;加兰他敏;高效液相;指纹图谱

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）6-0014-05

Abstract：Objective To establish the HPLC fingerprints of the artificial cultivation Lycoris aurea（LHer.）Herb. ethanol extract. Methods The analysis of Lycoris aurea （LHer.）Herb. ethanol extract was developed on a 30℃ thermostatic ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6×250mm，5μm），with the mobile phase comprising of Methanol -0.3% phosphoric acid flowing at 1.0 mL /min in a gradient elution manner，and the detection wavelength was set at 238 nm.Results It was determined 13 characteristic peaks with galantamin as reference material，which has. The HPLC fingerprints of 10 samples showed over 0.9 similarities to the common pattern of HPLC fingerprint. Conclusion The method is simple in operation and accurate in results， and it can provide a reference for the identification and intrinsic quality evaluation of Lycoris aurea （LHer.）Herb.

Key words：Lycoris aurea （LHer.）Herb.;Flowers;Galantamine;HPLC;Fingerprint

黄花石蒜（Lycoris aurea（LHer.）Herb.），又名忽地笑，为石蒜科（Amaryllidaceae）石蒜属（Lycoris Herb.）的多年生草本植物，主要分布在广西、湖南、贵州、广东等省地[1]，其鳞茎外包有暗褐色膜质鳞被，叶扁长线形，似大蒜，因而得其名。其性味辛、甘、温，有毒，具有消肿、杀虫作用[2]。黄花石蒜中含有多种生物碱，如石蒜碱、加兰他敏、力可拉碱等[3-5]，其中加兰他敏（Galanth amine）是一种可逆性胆碱酯酶抑制剂，易透过血脑屏障，产生较强的中枢作用，其临床药用形式是氢溴酸加兰他敏，可广泛用于阿尔茨海默氏症（Alzheimers disease，AD）、重症肌无力、儿童脑性麻痹症、多发性神经炎及由于神经系统疾病或外伤所引起的感觉运动障碍等症治疗[6-9]。

中药指纹图谱的测定方法有很多，其中HPLC法由于具有分离效能高分析速度快等优点[10-12]， 近期已广为普及用于中药的定量分析，在中药的定性鉴别中亦能发挥很好的作用[13]。本研究采用HPLC指纹图谱技术，以黄花石蒜枯萎初期花为研究对象，建立黄花石蒜醇提物的指纹图谱，为黄花石蒜的鉴定及内在质量评价提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260LC高效液相色谱仪，含二元泵、手动进样器、紫外检测器、柱温箱，ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）（安捷伦科技有限公司）;电热恒温水浴锅DK-98-1型（天津市泰斯特仪器有限公司）;电子天平FA2004（上海恒平科学仪器有限公司）;《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》（国家药典委员会发行）。

1.2 材料 10批药材分别收集于湖南省浏阳大围山、南岳衡山、湖南中医药大学药植园的人工栽培黄花石蒜基地，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为石蒜科（Lilicaeae）石蒜属（Lycoris）植物黄花石蒜（Lycoris aurea（LHer.）Herb.），样品来源详见表1。将黄花石蒜花置于60℃烘箱内烘干，粉碎，过60目筛，备用。

1.3 试剂 加兰他敏对照品（南京泽朗医药科技开发有限公司，纯度为99%）;95%乙醇、盐酸、甲醇、三氯甲烷、氨水、磷酸均为分析纯;重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取加兰他敏对照品0.00498g，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得浓度为0.498mg/mL的对照品贮备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取黄花石蒜各组粉末约5g，精密称定，加95%乙醇50mL，水浴加热回流1h，提取2次，过滤。滤液水浴挥干，残渣加0.1mol/L盐酸25mL溶解，过滤。滤液加氨水调pH9.0，然后以三氯甲烷萃取3次，每次25mL，合并萃取液，水浴挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10mL，再精密量取1mL，用甲醇定容至5mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得[14-16]。

2.2 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6×250mm，5μm）;流动相：甲醇（A）-水（含0.1%磷酸，B），梯度洗脱见表2;柱温：30℃;紫外检测波长：238nm;流速：1.0mL/min;进样量：10μL。

2.3 指纹图谱的方法学考察

2.3.1 精密度实验 精密吸取同一浓度供试品溶液（2号样品）10μL，在“2.2 色谱条件”项下连续进样6次，测得各特征色谱峰相对保留时间的RSD值均小于3%，表明实验仪器的精密度良好。结果见表3。

2.3.2 稳定性实验 精密吸取同一浓度的供试品溶液（2号样品），分别于制备后0、2、4、6、8、10h在“2.2 色谱条件”项下进样10μL，测得各特征色谱峰相对保留时间的RSD值均小于3%，表明供试品溶液在10h内稳定。结果见表4。

2.3.3 重复性实验 取同一供试品（2号样品）平行制备5份样品溶液，分别精密吸取 10μL并在“2.2 色谱条件”项下进样，测得各特征色谱峰相对保留时间的RSD值均小于3%，表明本测定方法的重复性良好。结果见表5。

2.4 对照品溶液测定 取对照品溶液10μL注入液相色谱仪，按“2.2 色谱条件”项下测定，记录色谱图，即得对照品色谱峰图，见图1。

2.5 样品测定 取供试品溶液各10μL注入液相色谱仪，按“2.2 色谱条件”项下测定，记录HPLC色谱图（见图2）。在供试品色谱图中，以加兰他敏色谱峰6号（S峰）的保留时间和色谱峰面積为1，计算各指纹峰的相对保留时间，结果见表6。

2.6 指纹图谱的建立与分析

2.6.1 指纹图谱的建立及共有峰的确定 根据供试品溶液测定结果，采用相对保留时间标定指纹图谱，记录50min的色谱图，以加兰他敏为参比物（S），将各指纹图谱保留时间与同一图谱中参照物的保留时间（设定为1）比较，其比值为各指纹峰的相对保留时间。计算10批药材指纹图谱中各指纹峰的相对保留时间（见表6），确定了13个共有特征峰（见图3），其中6号特征为参比色谱峰。

2.6.2 不同生长年限及不同产地的黄花石蒜花的相似度评价 将各样品色谱图的原始数据文件以AIA格式输出，应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）》对其进行处理，并以10批供试品品生成的对照图谱（中位数法）作为对照模板，通过自动匹配，计算得出各色谱图的整体相似度介于0.917～0.996之间（见表7），表明10批药材具有较高的相似度。

3 讨论

根据黄花石蒜前期研究[17]，黄花石蒜不同器官中加兰他敏含量测定结果，花中各器官加兰他敏含量高低依次为： 花>根>花葶>鳞茎，提示黄花石蒜中加兰他敏含量主要集中在花中，其含量远远高于其传统入药部位地下鳞茎。长期以来一直采挖地下鳞茎导致了野生资源濒临枯竭、生态环境严重破坏、药材原料供应紧张。采收人工栽培黄花石蒜的花作为原料可以有效保护濒临枯竭的野生资源和生态环境，确保资源的可持续利用。同时，黄花石蒜为多年生宿根植物，每年都可以采收花，种植效益高，受益时间长，生产成本低，采收劳动强度小等优势。黄花石蒜花的最佳采收期研究中确定了盛花期及其后的枯萎期是人工种植的最佳采收期[18]。故本研究对象采用黄花石蒜枯萎初期的花。

从表6样品指纹峰相对保留时间计算结果可以看出，其共有峰相对保留时间RSD值介于0.00%～0.29%之间，且均小于0.3%，没有明显差异;根据表7人工栽培黄花石蒜10批药材相似度结果整体来看，相似度结果均在0.9以上，具有较高的相似度。因此，可以说明不同生长年限及不同产地的黄花石蒜花的指纹图谱成分具有一致性。通过本研究确立了13个特征峰，其中6号参照峰为加兰他敏，其结果与文献[19]报道基本一致。

通过采用HPLC技术，并以加兰他敏为参比物建立了黄花石蒜花的醇提取物的HPLC指纹图谱，该方法操作简便，结果准确，为更快速的鉴别药材，并有效地控制黄花石蒜花的内在质量，保证药材、中药饮片及其中药制剂质量的稳定性提供了科学依据。

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（收稿日期：2019-12-13 编辑：刘斌）