黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞ABCA1表达与胆固醇含量的影响

许丽婷 徐彬人 盛蒙 吴琼 王文佳 田维毅 俞琦

【摘 要】 目的：观察黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）表达及胆固醇含量的影响，探讨黄连解毒汤抗动脉粥样硬化的可能作用机制。方法：SD大鼠给予大、中、小剂量黄连解毒汤灌胃后制备含药血清。用氧化低密度脂蛋白（ox -LDL）诱导RAW264.7巨噬细胞分化为泡沫细胞，将细胞分为空白组、模型组、黄连解毒汤含药血清大剂量组、中剂量组、小剂量组，每组1.5×106个细胞，分别加入无血清培养液和不同浓度含药血清干预24h，总胆固醇及游离胆固醇试剂盒检测细胞中胆固醇含量，实时荧光定量PCR检测细胞ABCA1 mRNA的表达。结果：与模型组比较，黄连解毒汤含药血清各剂量组泡沫细胞内总胆固醇（TC）含量明显降低（P<0.05或P<0.01），大剂量组游离胆固醇（FC）含量显著下降（P<0.01）;含药血清各剂量组ABCA1 mRNA表达均明显升高（ P<0.05）。结论：黄连解毒汤上调泡沫细胞ABCA1的转录与表达，促进胆固醇流出，可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。

【关键词】 黄连解毒汤;泡沫细胞;ABCA1;胆固醇;动脉粥样硬化

【中图分类号】R285 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）6-0010-04

Abstract：Objective To observe the effect of serum containing Huanglian Jiedu Decoction on the expression of ATP-binding cassette transporter（ABCA1） and cholesterol content in foam cells.To explore the possible mechanism of action of Huanglian Jiedu Decoction against atherosclerosis. Methods SD rats were given Large， medium and small doses of Huanglian Jiedu Decoction to prepare drug-containing serum. RAW264.7 macrophages were induced to differentiate into foam cells by oxidized low density lipoprotein （ox-LDL）. The cells were divided into control group， model group， Huanglian Jiedu Decoction-containing serum high-dose group， medium-dose group， and low-dose group. 1.5×106 cells in each group were added to serum-free medium and different concentrations of drug-containing serum for 24h. The total cholesterol（TC） and free cholesterol（FC） kits were used to detect the cholesterol content in the cells， and the expression of ABCA1 mRNA was detected by quantitative real-time PCR.Result Compared with the model group， TC content in the foam cells of Huanglian Jiedu Decoction group was significantly decreased （P<0.01）， and the FC content in the high dose group was significantly decreased （P<0.01）. The expression of ABCA1 mRNA in serum dose group was significantly increased （P<0.05）.Conclusion Huanglian Jiedu Decoction up-regulates the transcription and expression of foam cell ABCA1 and promotes cholesterol efflux， which may be one of the mechanisms of its anti-atherosclerosis.

Key words：Huanglian Jiedu Decoction; foam cells; ABCA1; cholesterol; atherosclerosis

黃连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子四味药物组成，是清热解毒最具代表的方药之一，具有泻火解毒功效，主治热毒充斥三焦之证。其临床应用非常广泛，对Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、老年性痴呆等病症有明显疗效[1-3]。现代研究证实，黄连解毒汤可通过抗炎、降血脂、抑制血管平滑肌细胞增殖等方面发挥抗动脉粥样硬化作用[4]。但其对细胞内胆固醇含量的影响及作用机制尚不明确。三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）是调控细胞胆固醇流出的有效途径，其表达不足将导致巨噬细胞内沉积大量的胆固醇，加重动脉粥样硬化病变。本研究拟采用黄连解毒汤含药血清干预泡沫细胞，观察黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞ABCA1蛋白及胆固醇含量的影响，探讨黄连解毒汤是否通过调节ABCA1蛋白表达及泡沫细胞胆固醇流出而发挥抗动脉粥样硬化作用。为其临床应用提供实验基础和科学依据。

1 材料

1.1 细胞株 小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，购自上海中侨新舟。

1.2 药物与试剂 黄连、黄芩、黄柏、栀子购自同仁堂贵阳药店，经贵州中医药大学生药教研室鉴定为正品。胎牛血清（美国Hyclone公司），DMEM和青链霉素混合液（美国Gibco公司），氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，广州奕源生物），总胆固醇及游离胆固醇检测试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司），逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）。ABCA1和β-actin引物（上海生工生物工程）。

1.3 动物 健康SD大鼠24只，SPF级，雌雄各半，体质量（200±20）g，购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，许可证号： SCXK-（ 军） 2012-0011。

1.4 主要仪器 SW-CJ-1F超净工作台（苏州净化）;PCR 仪（美国ABI Applied Biosystems）;ELX800全自动酶标仪（美国BioTek公司），细胞培养箱（美国Thermo公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 制备黄连解毒汤含药血清 上述药材按传统方法进行水煎煮，煎煮两次，合并两次滤液，即得黄连解毒汤水煎剂。调整浓度为相当于生药2g/mL，置4℃冰箱备用。SD大鼠采用随机数字表法分为正常组，黄连解毒汤大、中、小剂量组，每组6只。大、中、小剂量组分别以6、3、1.5g生药/kg灌胃给药，体积为1mL/100g（大鼠体重）;正常组给予等体积蒸馏水。2 次/d，连续7 d。末次给药后股动脉采血，常规制备血清，56℃ 30min 灭活补体，0.22μm过滤除菌，-80℃冰箱保存备用。

2.2 细胞培养及分组 細胞复苏后，用含10 %胎牛血清和1 %双抗（青霉素+链霉素）的DMEM培养基培养RAW264.7细胞，计数并调整细胞浓度，取对数生长期的细胞进行实验。以2×105个/m L的浓度接种于96孔培养板，用ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型后进行后续实验[5]。细胞分为：空白组、模型组（培养液+80μg/mL ox-LDL）和黄连解毒汤大、中、小剂量组（20%黄连解毒汤含药血清大、中、小剂量+80μg/mL ox-LDL）。每组设6个复孔，培养24h。

2.3 泡沫细胞油红O染色 用PBS液洗涤各组细胞，用50%异丙醇进行固定，油红O工作液染色15min后冲洗5min;苏木精染色10min，冲洗，氨水返蓝后显微镜下观察，红色颗粒为蓄积的脂质。

2.4 泡沫细胞中胆固醇含量的测定 裂解各组细胞，收集裂解细胞上清液，测定各组细胞内总胆固醇（TC）和游离胆固醇（FC）的含量。具体按胆固醇检测试剂盒说明书操作。

2.5 RT-PCR检测细胞ABCA1 mRNA的表达 收集细胞，用Trizol提取总RNA后，紫外分光光度计测定 RNA 的浓度以及纯度。按逆转录试剂盒说明书逆转录合成 cDNA，PCR条件： 95℃预变性 30s，95 ℃ 5 s、60℃ 40s，扩增40个循环。ABCA1引物序列为：上游：5′-TAC CAG CAT TAA GGA CAT GCA C-3′;下游：5′-TTT GAT CCG TTA CAC AGA CTG G-3′。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析RNA，分析各组目的基因的灰度值，以目的基因与β-actin基因的比值代表ABCA1 mRNA的表达。

2.6 统计分析 应用SPSS 18.0软件进行数据分析，计算结果以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为有统计意义。

3 结果

3.1 黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞的影响 油红O染色显示，空白组细胞无着色，模型对照组细胞形态呈空泡样，泡沫细胞中有大量脂质蓄积。与模型组比较，黄连解毒汤含药血清小、中和大剂量组泡沫细胞内脂滴显著减少，大剂量组细胞内脂滴减少最明显（见图1）。

3.2 黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞中胆固醇含量的影响 与空白组相比，模型组细胞内胆固醇含量明显升高（P<0.01）。与模型组比较，黄连解毒汤含药血清小、中和大剂量组细胞TC含量明显下降（P<0.05或P<0.01）;黄连解毒汤含药血清大剂量组细胞FC含量显著降低（P<0.01），小和中大剂量组无明显差异（见表1）。

3.3 黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞ABCA1 mRNA表达水平的影响 如图2所示，与模型组比较，在黄连解毒汤含药血清的干预下，随着剂量的增加，细胞的ABCA1 基因表达明显升高（P<0.01）。

4 讨论

动脉粥样硬化是引发心血管疾病的主要原因，可导致患病人群高死亡率。动脉粥样硬化是一种由斑块堆积引起的动脉内部狭窄的疾病，其斑块的主要成分是脂肪、胆固醇、钙和血液中其他物质。在动脉粥样硬化的早期阶段，随着胞内的ox-LDL堆积、脂质负载，巨噬细胞转为泡沫细胞。病理过程中泡沫细胞凋亡，将胆固醇释放到血管中，促进动脉粥样硬化病变[11] 。ABCA1是一种膜转运蛋白，激活的ABCA1可促进游离胆固醇和磷脂外流形成HDL颗粒，从而影响胆固醇从巨噬细胞的流出，因此在AS的发病机理中起重要作用[12]。中医认为动脉粥样硬化主要的三大病理因素是湿热、毒邪和痰淤。黄连解毒汤具有清热燥湿、泻火解毒之功效，主要用于治疗三焦火毒热盛的症状，可用于抵抗动脉粥样硬化的病变进程[13]。本研究通过观察黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞的作用效果，探讨黄连解毒汤抗动脉粥样硬化的作用机制。

本实验中，与模型组比较，黄连解毒汤含药血清组泡沫细胞的油红O染色中脂滴显著减少，且大剂量组脂滴减少最明显，说明黄连解毒汤减少泡沫细胞内脂滴含量，且有剂量依赖性。与空白组相比，模型组细胞内胆固醇含量明显升高。与模型组比较，黄连解毒汤含药血清小、中和大剂量组细胞TC含量明显下降;说明黄连解毒汤可以下调泡沫细胞脂滴含量，并有剂量依赖性。黄连解毒汤含药血清大剂量组细胞FC含量显著降低，小和中大剂量组无明显差异。说明大剂量的黄连解毒汤可促进FC外排。与模型组比较，在黄连解毒汤含药血清的干预下，随着剂量的增加，泡沫细胞的ABCA1 基因表达明显升高，说明黄连解毒汤可促进ABCA1基因的表达。

综上所述，本研究发现黄连解毒汤上调泡沫细胞ABCA1的转录与表达，促进胆固醇流出，可抑制动脉粥样硬化的进展。ABCA1可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一，这对临床治疗动脉粥样硬化病变具有指导意义。

参考文献

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（收稿日期：2019-12-24 编辑：刘斌）