2017～2019年江西主要城区钩端螺旋体病流行病学调查

戴宗浩 ，彭梦华，孙 毅 ，徐 黎 *

（1.公安部南昌警犬基地，江西南昌330100；2.江西农业大学）

钩端螺旋体病（leptospirosis，简称钩体病）是由致病性钩端螺旋体所引起的一种人兽共患的自然疫源性传染病。江西地区因其独特的地理位置和气候特点而成为我国钩端螺旋体病的主要自然疫源地之一，导致该病在江西地区广泛流行，造成严重的经济损失和公共卫生危害。随着国家对疾控工作的重视和投入，2005年江西省在钩体病高发地区设立了4个国家级钩体病监测点：上饶县、上高县、上犹县及浮梁县[1]，逐步了解了江西地区，尤其是以鼠及猪、水牛等经济动物为主要储存宿主的广大农村疫源地钩端螺旋体的流行病学特点，为钩体病的防控提供了准确依据，有效降低了钩体病的发生和流行。近10年来，江西省钩体病的发病率已经处于较低水平。但是随着经济水平的提高，城市伴侣犬饲养越来越来多，同时因监管缺失，各个城市中的流浪犬也逐渐增多，以鼠、犬为主要储存宿主的城市钩体病疫源圈逐渐形成。当人与犬直接或间接接触时，就会增加人体暴露钩体病的风险。本研究的主要目的是明确江西省主要城区致病性钩端螺旋体的流行规律及分子流行病学特征，为江西省全面防控钩体病提供科学参考。

1 材料

1.1 样本来源

本研究在江西省选择南昌、宜春、赣州和上饶四个城市作为调研地。于2017年1月至2019年12月随机在四个城市的街道及居民区布控鼠笼，共捕获老鼠521只；在四个城市的流浪犬收容所随机采集流浪犬血液样本188份；在四个城市的犬籍登记处随机采集宠物犬血液样本254份。并做好样本信息记录工作。

1.2 主要仪器

GeneAmp PCR System 9700购自美国Applied Biosystems公司；电泳仪、水浴锅购自北京市六一仪器厂；凝胶成像系统为美国UVP EC3 Imaging System；台式高速离心机购自美国Beckman公司；Nan-odrop 2000购自美国ThermoScientific公司。

1.3 主要试剂

细菌基因组DNA提取收试剂盒、血液/细胞/组织DNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Ex Taq 2×PCR mix、DNA Marker DL 1000/500购自大连宝生物工程有限公司；EMJH培养基（成品）购自吉林大学动物医学院实验室；钩端螺旋体肉汤基础EMJH购自碧迪医疗器械（上海）有限公司。

2 方法

2.1 样本处理

活鼠样本处理：解剖，摘取两侧肾脏，无菌操作剪取米粒大小肾脏组织一块直接接种于3 mL EMJH培养基中培养；另取约一半的肾脏组织于1mLEP管中，用剪刀剪碎后加入1 mL EMJH培养基，吹打混匀使组织碎块悬浮，静置5～10min，取200μL上清液接种于3mLEMJH培养基中培养。

犬血液样本处理：无菌操作取血液2～3滴接种于3 mLEMJH培养基中培养。

将上述培养管置于28℃的恒温培养箱中培养。

2.2 样本分离培养纯化

2.2.1 样本分离培养

每周取一次培养物制片（取5μL培养液置于载玻片上，盖上盖玻片），用暗视野显微镜观察有无疑似钩端螺旋体生长，如有，则接种于新鲜培养基中。如无生长，继续培养观察60d，仍无菌生长作为阴性处理。

2.2.2 培养物纯化

将镜检有杂菌生长的疑似钩体培养物采用生物过滤法[3]进行纯化培养，即将污染有杂菌的疑似钩端螺旋体培养物1 mL接种于50～80g金黄地鼠腹腔内，一般在1～2h内以无菌操作采集心血2～3滴，接种到培养基中，再进行培养。

2.3 PCR检测

2.3.1 引物合成

通过查阅相关文献[2]得到引物序列详细信息见表1，将该引物序列于NCBI数据库中BLAST进行验证，检测引物特异性，将钩端螺旋体基因引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

2.3.2 样本DNA的提取

表1 引物名称、序列及扩增片段

参照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书步骤，提取样本基因组DNA。并用Nanodrop 2000将提取得到的钩体基因组DNA进行定量。

2.3.3 PCR扩增

采用25μL反应体系（见表2）：

表2 25μL反应体系

PCR反应条件：第一个循环包括94℃3 min，63℃1.5 min，72℃2 min，接下来的29个循环包括94℃ 1 min，63℃ 1.5 min，72℃ 2 min，最后 72℃延伸10 min[2]。

反应结束后，取10μL扩增产物，用2%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)电泳检测PCR产物，在紫外灯下观察，使用数字凝胶成像系统观察实验结果。

2.4 基因测序

对于纯化的钩体培养物，直接提取钩体菌液DNA，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序。

对于PCR结果阳性，但污染严重，无法纯化的培养物，通过基因克隆技术，将重组菌液送上海生工生物工程有限公司进行测序。

2.5 mLST基因分型

mLST七个位点PCR扩增、测序参考文献报道mLST方案[4]，利用 7 个位点 pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB进行PCR扩增，各位点信息见表3，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

表3 mLST研究中7个位点信息

利用 25μL反应体系：Premix Ex Taq12.5μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1μL，DNA 模板 2μL，ddH2O补充8.5μL至25μL反应体积。

PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1min，扩增 30 个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物纯化、双向测序，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

将每株菌株测序的上下引物序列用DNASTAR软件中的SeqMan软件进行拼接，然后用BioEdit软件进行序列分析，再将7个位点序列与mLST(网站http：//pubmLst.org/)上相应等位基因进行比较，即可获得每株菌等位基因谱（glmu-pnta-suca-tpia-pfkb-mrea-caib）以及 STs(Sequence Types)型别，再通过数据库查询可得钩体的血清群血清型。

3 结果

3.1 样本的分离纯化结果

通过对963份样本进行分离培养及纯化，共培养45份阳性培养物，最终纯化出21株菌株，有24株未能纯化。

3.2 特异性PCR扩增结果

用钩端螺旋体的特异性引物对纯培养分离菌株和基因克隆的菌液进行PCR扩增，均能得到331bp的特异性条带（见图1）。

3.3 基因种鉴定结果

图1 特异性PCR扩增结果

将21株纯培养分离菌株的PCR扩增产物和24份基因克隆菌液送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序，并将测序的结果通过NCBI的BLAST序列比对。经核苷酸序列测定分析证实上述序列与钩端螺旋体菌FDAARGOS_203基因序列(GenBank登录号：CP020414.2)同源性为100%，证明所分离到的菌是问号钩端螺旋体。

3.4 城市钩体病流行病学分析

3.4.1 样本钩体阳性率统计结果

963份样本，钩体阳性率统计结果见表4：

表4 样本PCR检测结果

3.4.2 城市犬钩体感染率与季节分布

城市犬钩体感染率与季节分布关系见表5：

表5 犬钩体感染率与季节分布

3.4.3 城市鼠带菌率与地区分布

鼠带菌率与地区分布关系见表6：

表6 鼠带菌率与地区分布

3.5 mLST鉴定

mLST研究结果显示：21株致病性钩端螺旋体呈现同一个ST型别：93，属于钩端螺旋体澳洲群澳洲型（australis），结果如表 7：

表7 mLST结果

4 讨论

钩端螺旋体病是一种重要的人畜共患自然疫源性疾病，也是国家规定的乙类传染病，具有重要的公共卫生意义。江西地区是钩体病的老疫区，早年的发病率常年居全国前列。随着国家的经济发展和对人民健康水平的重视，江西省基本完善了对广大农村疫源地的流调工作，建立健全了钩体病的监测及防控机制，有效控制了该病的发生和流行。但是，随着城市养犬热的兴起，以鼠和犬为主要储存宿主的城市钩体病疫源圈逐渐形成，但针对城市钩端螺旋体病的流调研究却鲜见报道。而对城市钩体病的监测缺失，一定程度上会影响钩体病的防控全局，造成严重的公共卫生隐患。

本研究从江西省选择四个地理位置具有代表性的城市（南昌、宜春、上饶和赣州）作为调研地，调查江西省城市钩端螺旋体流行病学特点。四个城市的鼠肾平均钩体分离率为5.95%，四个城市的鼠肾钩体分离率无显著差异，并且高于张翠彩等2019年报道的江西省鼠类动物钩端螺旋体的分离率4.56%[1]。流浪犬和宠物犬的血液钩体阳性率分别达到4.79%和1.97%，显著高于娄银莹等报道的2017-2019北京地区犬钩端螺旋体分子流行率1.06%，尤其是流浪犬的钩体带菌率[5]。这个数据说明，江西地区以鼠和犬为主要储存宿主的城市钩端螺旋体疫源圈已然形成，同时由于犬与人类的关系比猪和牛等经济动物更加亲密，更加加大了钩端螺旋体从动物感染人的风险，存在严重公共卫生隐患。

通过本次调研发现，江西地区城市犬只冬季的阳性感染率显著高于其他季节，这与其他文献报道的钩体病季节性分布不一致。我国人钩体病的流行高峰在夏季的7、8月及初秋的9月左右[3]；徐建民等2010年报道江西省人钩体病有明显的季节性分布，7～8 月为高峰[6]；娄银莹等报道的 2017～2019 年北京地区犬钩端螺旋体感染率秋季（9～11月）最高[5]。江西省城市犬只钩体季节性分布与文献报道不一致的主要原因可能是由于人和犬感染钩端螺旋体的途径不同以及鼠源疫源分布的变化导致的。根据徐建民等研究分析，江西省人感染钩体病的途径主要是接触疫水，因此人钩体病的发生主要集中在7～8月夏季农忙时节。而城市犬感染钩体的主要途径是接触带菌老鼠污染的水源或饲料。冬季老鼠户外食源减少，对室内食物的污染相应增多，因此犬接触污染食物的几率也相应增加。

本研究共分离钩端螺旋体纯化菌株21株，经mLST基因分型，21株钩体全部都是同一个ST型别：93，属于澳洲群澳洲型。根据相关文献的报道，徐建民等对2002～2008年江西监测菌株研究发现：黄疸出血群赖型、澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型是江西省人群及宿主动物中的优势型别[7]；张翠彩等报道黄疸出血群和ST1型别为2016～2018年江西鼠类的优势型别，并且血清群和ST型别分布在江西省地域差异明显[1]。娄银莹等通过对2017～2019年北京地区犬钩端螺旋体病的流行病学调查发现澳洲群和拜伦群是北京地区犬钩端螺旋体病的优势菌群[5]；本次研究发现江西省城市中以鼠和犬为主要宿主的钩端螺旋体优势菌群为澳洲群澳洲型，与北京城区的优势菌群一致，但与江西省农村疫源地的流行菌群不一致，其主要原因有3点：（1）疫源地环境不同。城市环境和农村环境存在根本不同，城市环境相对比较容易控制；（2）储存宿主不同。城市钩体病的储存宿主相对单一，主要是鼠和犬。而农村疫源地储存宿主较复杂，以鼠、猪、水牛等为主；（3）人为干预程度不同。城市中大多数宠物犬都会接种钩体疫苗，而目前市售钩体疫苗主要就是预防黄疸出血型和犬型钩端螺旋体病。一定程度上抑制了出血黄疸型钩端螺旋体病在城市中流行。