番鸭巴氏杆菌的分离鉴定及体外抑菌实验

陈飞虎 ，张梦娟 ，周亚南 ，高 蕊，区海蕴，刘雨星，王笑焓，朱芝秀

(江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045)

巴氏杆菌是一种两端钝圆，中间稍微向外凸出的G-短杆菌[1]，是造成巴氏杆菌病的病原菌，病料瑞氏染色特征为两极浓染[2]。临床上，巴氏杆菌病是一种表现为畜禽急性、败血性的一类疾病[3]，牛鸡鸭猪兔等均有可能感染该传染病[4]，鸭场中易群发该病，发病传染急而迅速，并且病鸭短时间死亡[5～6]，对养禽场造成严重损害。2019年4～6月间，南昌某番鸭养殖场爆发疑似巴氏杆菌病例，本试验通过对疑似病例进行病理解剖及细菌分离培养鉴定等操作，为对番鸭巴氏杆菌的防治提供良好建议与适当方法。

1 材料

1.1 实验动物

病料：某养殖场病死成年番鸭；试验小白鼠：18～22g，南昌大学实验动物室购买。

1.2 实验仪器及药品

电子数显微游标卡尺（购自上海美耐特旗舰店）；PCR仪（购于Bio-Rad公司）；牛津杯（购自上海申源科学仪器有限公司）；微量生化管及药敏试纸（购自杭州天和微生物有限公司）。

2 方法

2.1 细菌分离鉴定

2.1.1 病理检查

临床解剖：观察气管环、喉头、肺、心肌及心内外膜、心冠脂肪、肠黏膜等组织出血状况；观察肝脏病变情况；截取心脏、肝脏病变部位进行瑞氏染色镜检。

2.1.2 细菌分离培养

无菌操作取死亡鸭心、肝器官，勾取病变部位划线接种5%兔血平板，37℃温箱静置24h，观察血平板优势菌落形态、溶血状况等；接种环无菌操作挑取单个典型菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态；挑取镜检菌落再次划线接种5%兔血平板进行纯培养，分离菌命名为：Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2。

2.1.3 分离菌生化反应实验

勾取 Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2，分别接种微量生化反应管，同时在微量生化反应管中滴加无菌血清1～2滴，37℃下静置1～2d，观察生化反应管反应情况，对照生化反应说明书分析并记录结果。

2.1.4 分离菌分子生物学鉴定

根据细菌16srDNA通用引物[7]，用细菌常规扩增法对分离菌进行PCR扩增[8]。由湖南擎科生物科技有限公司测序，进入Blast系统进行16srDNA同源性分析，利用DNAStar软件构建16srRNA系统进化树。

2.2 分离菌体外抑菌

2.2.1 药敏试验

无菌条件下，均匀涂布 Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2发酵液于血清平板，用眼科镊夹取药敏纸片轻贴血清平板表面，记录药敏纸片药物名称及放置顺序，37℃静置24h，观察抑菌情况，游标卡尺测量抑菌圈的直径。

2.2.2 乳酸菌对分离菌体外抑制试验

将分离菌发酵液均匀涂布血清平板，其上对称放置2个牛津杯，把鸡唾液乳杆菌、猪小肠乳杆菌发酵液依次缓慢注入牛津杯内，3 7℃静置24h，观察抑菌现象并测量抑菌圈的直径。

2.3 动物致病性试验

将购买的试验小白鼠适应环境一周后随机分为5组。试验组分别腹腔注射Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2发酵液（0.1mL/只），对照组同样方式注射等量生理盐水。每天观察试验小白鼠的发病情况，对具有典型症状的死亡小白鼠进行细菌分离培养。

3 结果

3.1 临床检查结果

气管环出血（图1），心冠脂肪出血（图2），肝脏针尖状坏死（图3）。取肝脏瑞氏染色境检，表现为典型的两极着色（图4）。

3.2 病原菌分离培养结果

Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2 在 5%兔血平板上呈水滴样，半透明，不溶血（图5），经G染色镜检可见G-短杆菌（图6）。

图1 气管环出血

图2 心冠脂肪出血

图3 肝脏针尖状坏死

图5 分离菌血平板菌落

图6革兰氏染色结果

图4瑞氏染色结果

3.3 分离菌生化试验结果

由 表 2 可 知 ：Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2可分解葡萄糖等，其中Y-X-2分解麦芽糖等产酸产气，另外3株分离菌不产气只产酸，乳糖不分解。

表2 分离菌生理生化特性

3.4 分离菌分子生物学鉴定结果

电泳结果如图7所示，目的条带在约1800pb处出现。扩增后的序列与多杀性巴氏杆菌同源性高至 99%（图 8），Y-G-1与 MG597107.1菌株，Y-X-1与KX579748.1菌株的亲缘关系最近，进化树上处于同一分支（图9）。

图7 分离菌电泳结果

3.5 分离菌药敏试验结果

由表3可知，分离菌对头孢曲松等抗生素敏感，对克林霉素等耐药

3.6 乳酸菌对分离菌体外抑制试验结果

图8 分离菌16S rDNA同源性分析

图9 分离菌16S rRNA序列进化树

表3 药敏试验结果 mm

见表4可知，两种不同源乳酸菌对分离菌均产生了抑制作用，显然鸡唾液乳杆菌对分离菌的抑制作用更明显。

表4 乳酸菌抑菌实验结果 mm

3.7 动物致病性结果

试验组小白鼠均死于攻毒后的12h之内，对照组生理状态正常。从解剖死亡小鼠脏器中分离到形态一致的细菌，染色镜检结果与原分离菌一致。

4 讨论

根据病理剖检、分离菌培养特性、生化试验等结果，对比《伯杰氏细菌分离鉴定手册》[9]，可初诊分离菌为巴氏杆菌；依据上述分子生物学鉴定结果，分离菌确诊为多杀性巴氏杆菌。

分离菌生化反应结果与刘燕发表的试验结果大致相同[10]，只有个别糖酵解试验不同，可能与菌株、地域差异有关。分离菌药敏试验结果，对阿莫西林等高敏，与刘杰等发表的论文结果不同，可能是用药习惯、菌株与地域不同造成[11]。

体外抑菌试验结果，乳酸菌对巴氏杆菌有较强的抑制作用，与边彦超等发表的文章一致[12～13]。乳酸菌与高敏药物配合使用，可以缓解抗生素泛滥所导致的耐药性问题。动物致病性试验结果，试验小白鼠均于12h内死亡，分离菌有较强的毒力，可能与菌株的荚膜有关[14]。

我国作为农业大国，畜牧业快速发展，集约化规模养殖也越来越普遍，禽类巴氏杆菌病作为一类高发接触性传染病更得受到重视。畜牧场应当建立合理的饲养标准，做好防治，保持空气流通，环境卫生等条件，同时做好免疫预防。一旦发现发病禽类个体，应当立即隔离，严格消毒污染场所，以防更大范围的感染，用药方面应当追求合理配药，防止滥用。