石斛合剂序贯法对db/db糖尿病小鼠血清LPS、IL-6、IL-10及糖代谢的影响

林晓晖 张捷平 陈 勇 郑燕芳 施 红

（福建中医药大学中西医结合学院，福建福州 350122）

随着城市化、老龄化以及生活方式的改变等，2 型糖尿病（T2DM）患病率逐年增高，已经发展成为我国常见的内分泌代谢性疾病[1]。T2DM 后期并发症致残、致死率高，消耗巨大的医疗资源，给患者和社会造成了极大负担。越来越多研究表明[2]，由炎症因子介导的慢性低度炎症引发胰岛素抵抗，是T2DM 发病的重要原因，但其机制复杂。其中肠道菌群失调、肠道屏障功能受损，导致循环系统中来自于革兰氏阳性菌细胞壁的脂多糖（LPS）水平升高，从而激活Toll 样受4（TLR4）信号通路，使血浆和组织促炎因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等水平增加，是导致慢性低度炎症及诱发胰岛素抵抗的重要机制之一[3]。前期研究表明，以石斛合剂基本方（现为福建省第二人民医院院内制剂）为基础，依从滋阴清热、益气活血、清肝泄浊法的石斛合剂序贯法，在治疗T2DM 及其并发症，纠正T2DM 的糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗等方面具有很好的疗效[4-5]。本实验旨在研究石斛合剂序贯疗法对糖尿病小鼠血清中LPS 水平、相关炎症指标及整体水平糖代谢的影响，从而分析其治疗糖尿病的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

db/db 小鼠18 只，平均体质量（44.6±3.5）g，db/m 小鼠6 只，平均体质量（23.6±1.5）g，均为12 ～ 13 周龄的无特定病原体动物（Specific pathogen Free，SPF）级雄性小鼠，由北京大学（医学部）实验动物科学部提供，许可证号：SCXK（京）2011-0012，于福建中医药大学实验动物中心SPF 级环境中饲养。实验期间，喂以普通饲料，自由饮水，环境温度20 ～ 23 ℃，相对湿度 55% ～70%，12 h 光照，昼夜循环。

1.2 药物、试剂及仪器

石斛合剂1 号方（石斛15 g，黄芪20 g，五味子8 g，丹参20 g，葛根15 g，生地黄18 g，玄参10 g，知母12 g），石斛合剂2 号方（茵陈18 g，大黄3 g，栀子10 g，柴胡6 g，萹蓄15 g，甘草6 g），购自福建中医药大学附属第三人民医院。采用常规水煎2 次后合并，过滤浓缩成含药量1.2 g/mL 的药液。二甲双胍缓释片配制浓度为20 mg/mL。

小鼠胰岛素（Ins）ELISA 试剂盒（YX-061899R）、小鼠脂多糖（LPS）ELISA 试剂盒（YX-064351R）、小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（YX-039315R）、小鼠白介素-10（IL-10）ELISA 试剂盒（YX-033912R）均购自北京议达成科技有限公司；糖化血清蛋白（GSP）测定试剂盒（果糖胺法，A037-1，20180718）购自南京建成生物技术公司；ELx800 型酶标仪购自美国Bio-Tek 公司。

1.3 方法

1.3.1 分组及给药

db/db 小鼠适应性喂养7 d 后，选取空腹血糖（FBG）≥11.1 mmoL/L 为糖尿病模型鼠，按FBG 和体质量随机分成三组：分别为模型组、石斛合剂序贯组（以下简称序贯组）和二甲双胍组，每组6 只。再取6 只同周龄表型正常的db/m 小鼠为正常对照组（以下简称正常组）。以上4 组小鼠灌胃给药，1次/d。其中，序贯组给予1号方12 g/（kg·d）连续4 d，再续以2 号方12 g/（kg·d）连续3 d 为1 个疗程，每个疗程之间停药1 d，连续给药8 个疗程（64 d）；二甲双胍组给予二甲双胍0.2 g/（kg·d）；正常组和模型组给予生理盐水10 mL/（kg·d）。各组小鼠每周称重1 次，根据体质量调整药液的灌胃体积。

1.3.2 血清学指标测定

分别在干预前及干预后2、4、6、8 个疗程，禁食不禁水10 h，采用割尾法取血，血糖仪检测各组小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）；干预8 个疗程（64 d）后，摘眼球取血，分离收集各组小鼠的空腹血清，采用果糖胺法测定血清GSP 含量，采用ELISA 法测定血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS）、脂多糖（LPS）、白介素-6（IL-6）和白介素-10（IL-10）的含量。计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR，计算公式：HOMA-IR=FBG（mmoL/L）×FINS（mU/L）/22.5[6]。

1.4 统计学分析

实验数据采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，采用t 检验。计数资料以[例（%）]表示，采用χ2检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干预前后各组小鼠FBG 的比较

干预前模型组、序贯组与二甲双胍组的FBG 均显著高于正常组（P ＜0.01），但模型组、序贯组二甲双胍组三组FBG 比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。从干预4 个疗程开始，序贯组与二甲双胍组的FBG 较模型组显著下降（P ＜0.05），二甲双胍组的FBG 与干预前比较也显著下降（P ＜0.05）。

干预8 个疗程后，序贯组与二甲双胍组的FBG 均比模型组显著下降（P ＜0.01），序贯组与二甲双胍组的FBG与干预前比较均显著下降（P ＜0.05），见表1。

表1 石斛合剂序贯法对db/db 小鼠FBG 的影响（±s，mmol/L）

表1 石斛合剂序贯法对db/db 小鼠FBG 的影响（±s，mmol/L）

注：与正常组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，▲P ＜0.01；与本组干预前比较，●P ＜0.05，★P ＜0.01。

组别 n 干预前 2个疗程 4个疗程 6个疗程 8个疗程正常组 6 5.85±0.67 5.95±0.75 5.72±0.78 6.00±0.70 6.05±0.74模型组 6 18.78±3.05* 18.95±2.60* 20.30±2.29* 21.05±1.91* 22.42±2.16*序贯组 6 19.03±3.62* 18.45±1.98* 17.25±1.91*# 16.87±3.43*# 15.80±2.14*▲●二甲双胍组 6 18.97±3.06* 17.67±3.73* 15.75±2.97*▲● 13.88±2.52*▲★ 13.32±2.46*▲★

2.2 各组小鼠GSP、FINS 与HOMA-IR 的比较

干预8 个疗程后，模型组血清GSP、FINS 和HOMAIR 均显著高于正常组（P ＜0.01），表明db/db 小鼠长期处于高血糖、高胰岛素血症及高胰岛素抵抗状态。与模型组相比，序贯组和二甲双胍组血清GSP（P ＜0.01）、FINS（P ＜0.01）及HOMA-IR（P ＜0.01）均显著降低。序贯组和二甲双胍组在干预结束后GSP 含量与正常组比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表2。

2.3 各组小鼠血清LPS、IL-6 和IL-10 的比较

干预8 个疗程后，模型组的LPS、IL-6 均高于正常组（P ＜0.01），IL-10 低于正常组表明db/db 小鼠处于内毒素血症及慢性炎症状态。与模型组相比，序贯组和二甲双胍组血清LPS 水平均显著降低两组血清LPS 水平比较差异有统计学意义（P ＜0.01）；序贯组和二甲双胍组血清IL-6 水平与模型组比较均显著降低（P ＜0.01），但序贯组和二甲双胍组血清IL-6 水平比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）；序贯组和二甲双胍组均显著升高血清IL-10水平与模型组比较（P ＜0.01），胆序贯组和二甲双胍组血清IL-10 水平比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表3。

表2 石斛合剂序贯法对db/db 小鼠GSP、FINS 和HOMA-IR 的影响（±s）

表2 石斛合剂序贯法对db/db 小鼠GSP、FINS 和HOMA-IR 的影响（±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.01。

组别 n GSP（mmol/L） FINS（mU/L） HOMA-IR正常组 6 3.83±0.24 22.24±4.59 6.05±1.46模型组 6 5.30±0.40* 62.62±4.53* 62.52±9.52*序贯组 6 4.03±0.69# 43.76±2.45*# 31.34±5.97*#二甲双胍组 6 3.95±0.30# 37.01±2.77*# 22.91±4.25*#

表3 石斛合剂序贯法对db/db 小鼠LPS、IL-6 和IL-10 的影响（±s）

表3 石斛合剂序贯法对db/db 小鼠LPS、IL-6 和IL-10 的影响（±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.01；与序贯组比较，▲P ＜0.01。

组别 n LPS（EU/L） IL-6（pg/mL） IL-10（pg/mL）正常组 6 566.43±39.88 127.43±10.31 561.89±71.73模型组 6 981.48±93.40* 294.35±17.58* 171.19±39.04*序贯组 6 762.88±45.46*# 241.40±14.53*# 498.38±61.74#二甲双胍组 6 665.08±45.71*#▲238.94±10.75*# 534.49±62.35#

3 讨论

T2DM 作为糖尿病的主要类型，患者以高血糖为显著特征，常伴随着肥胖和胰岛素抵抗。糖尿病在中医学中属于“消渴”的范畴，主要由饮食不节、情志不调、先天禀赋不足等各种因素引起，任其发展，多表现为气阴两虚，夹杂痰浊、湿热、瘀血阻于脉络。本研究采用的是施红教授 “滋阴益气、活血泄浊”的石斛合剂序贯法。石斛合剂序贯方中，1 号方滋阴清热、益气活血，2 号方清肝利湿泄浊。两方依序反复交替、循环治疗，称为石斛合剂序贯法[6-8]。前期研究表明，石斛合剂序贯法在临床上可以明显改善T2DM 患者燥热、烦渴、盗汗等症状，显著降低血糖、调节血脂等。基础研究中，石斛合剂及其序贯法亦能保护糖尿病模型鼠的胰腺组织、纠正糖脂代谢异常症状、抗氧化及降低炎症蛋白表达和释放等，并能延缓糖尿病并发症的发生发展[9]。

本研究选用的糖尿病模型鼠db/db 小鼠是从瘦素受体基因缺陷的C57BL / Ks 小鼠中筛选而来的突变系，表现为肥胖、高血糖、高胰岛素血症等代谢异常，常并发糖尿病微血管病变，是研究人类T2DM 理想的动物模型。由于db/db小鼠的瘦素受体基因缺陷，瘦素信号通路障碍，进而影响其对胰岛素分泌的抑制作用，胰腺β 细胞持续分泌胰岛素，引发高胰岛素血症。通过糖代谢相关血清学指标的检测表明，本实验研究结果与以往研究报道一致[10]，db/db小鼠与对照组db/m 小鼠相比，表现出高血糖、高胰岛素及胰岛素抵抗等症状。通过石斛合剂序贯法进行干预治疗后，db/db 小鼠的空腹血糖（FBG）逐渐下降，从第4 个疗程开始，与模型组有显著差异；治疗8 个疗程后，序贯组的FBG 与模型组的差异更加明显，但与二甲双胍组无显著差异。经过8 个疗程的干预，序贯组的血清空腹胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数均比模型组有显著降低，表明胰岛素抵抗状态得到缓解。

糖化血清蛋白（GSP）是血清中的葡萄糖与血清蛋白之间形成的高分子酮胺化合物。由于血清蛋白半衰期较血红蛋白短，该指标可以反映检测前3 周内平均血糖水平，且不受临时血糖波动的影响，可用于观测近期血糖控制的情况[11]。本研究中，模型组GSP 显著高于正常组，表明db/db 小鼠存在持续性高血糖的状态，而序贯组经过8个疗程的干预治疗，GSP 含量比模型组显著降低，但与正常组及二甲双胍组无显著差异。该结果表明，石斛合剂序贯法对稳定平均血糖水平发挥重要作用，干预后db/db 小鼠血糖控制良好。

T2DM病因和发病机制复杂。越来越多的研究表明[12]，由炎症因子介导的慢性低度炎症是糖尿病的发病及持续进展的重要原因。其中肠道微环境的改变与慢性低度炎症密切相关，由于肠道屏障功能受损而导致循环系统中来自于革兰氏阳性菌细胞壁的脂多糖（LPS）水平升高。LPS可通过LPS-TLR4 / NF-kB 信号通路，促进炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1 等的表达与释放。后者通过损伤参与糖脂代谢调节的重要器官（如胰腺、肝、肾等）的靶细胞，最终引起T2DM 的胰岛素抵抗及肥胖。IL-10 是一种重要的抗炎细胞因子，作为微生物抗原免疫应答的负调节因子发挥着重要作用。它能抑制巨噬细胞的活化，从而抑制其表达释放炎性细胞因子，发挥抗炎的功效[13]。本研究中，模型组LPS和IL-6均高于正常组，而IL-10水平低于正常组，表明db/db 小鼠处于内毒素血症和慢性低度炎症的状态。而经过8 个疗程的干预治疗，与模型组相比，序贯组的LPS和IL-6 水平降低，而IL-10 水平升高。该结果表明石斛合剂序贯法可以有效降低糖尿病小鼠的炎症反应，具有一定的抗炎作用。

综上所述，石斛合剂序贯法能够降低db/db 小鼠的血糖水平及胰岛素抵抗、缓解内毒素血症、有效降低糖尿病小鼠的炎症反应。这可能与其通过促进抗炎因子释放、参与维持肠道稳态、抑制内毒素脂多糖进入血液循环，从而降低糖尿病的胰岛素抵抗和减弱慢性低度炎症状态有关。但其通过何种机制保护肠道稳态和发挥抗炎作用，有待进一步研究。