松果菊苷对大鼠生精功能障碍的作用研究

王 莺，陈 雪，赖增妍，刘坤禹，赵东海* (1.延边大学医学院，吉林 延吉 133000；.吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 13013)

21世纪不孕不育已成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病，因生精功能障碍导致的男性不育占不孕不育发生率的50%[1]。自由基是维持机体正常新陈代谢的关键，机体内过多的自由基作用于细胞、组织等之后，会造成其氧化损伤，使细胞膜的功能降低，从而降低细胞的活力[2]。雄性生精功能障碍的发生与氧化应激损伤有一定的关系，研究表明，重金属铅对睾丸有严重的毒副作用，能够改变精子形态，减少精子数量，损害男性生殖的健康[3]。中医药法治疗治疗男性不育已有两千多年的历史，效果较好[4],但因中药成分复杂，多组分方剂的药理作用机制尚不清晰。松果菊苷是肉苁蓉的主要活性成分，且含量较高，在滋补肾阳方面有着重要作用[5]。本实验通过腹腔注射醋酸铅制备生精功能障碍大鼠模型，探讨松果菊苷对雄性大鼠生精功能障碍的改善和治疗作用，并分析相关的作用机制，为松果菊苷在生精功能障碍领域的应用和开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

松果菊苷(纯度≥99%)购自西安草翠芯生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、还原性谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。高速台式冷冻离心机购自德国赫曼公司；全自动酶标仪购自美国Bio-Rad公司；雪花制冰机购自北京长流科学仪器有限公司；倒置显微镜(TE2000U)，日本尼康株式会社。

1.2 动物分组及给药

SPF级雄性Wistar大鼠，体重(180±20)g,购自长春亿斯实验动物技术有限公司。大鼠分笼饲养，12 h/12 h昼夜循环交替，饲料供给充足，自由饮水。

将大鼠采用单纯随机抽样法分为6组(每组10只)：正常组(CON),模型组(MODEL),阳性对照组(VC),松果菊苷低剂(ECH L)、中(ECH M)、高剂量组(ECH H)。除正常组10只大鼠外，其余腹腔注射醋酸铅连续7 d，按体重给药(给药剂量为25 mg/kg)，制备醋酸铅中毒模型。

造模大鼠于第3天开始出现体重下降、行动迟缓，以及萎靡不振、皮毛稀疏等现象即造模成功。各组别灌胃相应剂量药物，阳性对照组给予VC 10 mg/(kg·d)灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，ECH L组、ECH M组、ECH H组分别给予25、50、100 mg/kg松果菊苷灌胃，连续30 d。末次灌胃后24 h，用10%的水合氯醛麻醉大鼠(按照3 mL/kg剂量注射)，取附睾检测精子存活率、活力、畸形率,取左侧睾丸检测超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、还原性谷胱甘肽(GSH)含量,取大鼠右侧睾丸组织做HE染色，观察组织学变化。

ECH L组 ECH M组 ECH H组

1.3 检测指标

精子质量的检测:末次灌胃24 h后，用10%的水合氯醛麻醉大鼠，每组随机取两只大鼠分离附睾，充分释放大鼠附睾内的精子，检测精子总数、精子活动率和精子畸形率。

睾丸组织中氧化应激指标的检测:检测睾丸组织中LDH、SOD、GSH水平，具体操作方法参照试剂盒说明书。

睾丸组织形态学观察:常规固定睾丸组织，石蜡包埋，制成石蜡切片(5 μm)，苏木精-伊红法染色后用酒精梯度洗脱，二甲苯透明，加中性树胶封片。显微镜下观察睾丸组织病理形态结构改变，并拍照。

1.4 数据统计分析

采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 精子质量

如表1所示，与正常组比较，模型组精子总数、精子活动率明显降低(P<0.05)，精子畸形率明显增加(P<0.05)；与模型组比较，松果菊苷各剂量组精子数量、精子活动率明显增加(P<0.05或P<0.01)，精子畸形率显著性降低(P<0.05)。松果菊苷对生精功能障碍大鼠精子质量改善存在剂量依赖关系。

表 1 大鼠精子质量

2.2 大鼠睾丸组织中LDH、GSH、SOD水平

如表2所示,与正常组比较，模型组大鼠睾丸组织LDH、GSH、SOD含量明显减少(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，松果菊苷低剂量组大鼠睾丸组织LDH、GSH、SOD水平有所增加，但不存在明显差异(P>0.05)；与模型组比较，松果菊苷中剂量组大鼠睾丸组织GSH含量明显增加(P<0.01)，LDH和SOD水平有所增加，但不存在明显差异(P>0.05)；与模型组比较，松果菊苷高剂量组大鼠睾丸组织LDH活力有所增加，但不存在明显差异(P>0.05)，GSH和SOD水平明显增加(P<0.05或P<0.01)。

表 2 大鼠睾丸组织LDH、GSH、SOD水平

2.3 大鼠睾丸形态学结构的观察

如图1所示，与正常组比较，模型组大鼠生精小管萎缩，生精上皮层数减少，生精细胞数量减少并排列紊乱，生精小管内精子数量减少。与模型组相比，松果菊苷低剂量组生精小管萎缩现象好转，生精上皮层数变多，上皮排列较规则。松果菊苷中剂量组生精小管结构改善更加明显，生精上皮层数多、排列整齐，

与正常组组比较:*P<0.05，**P<0.01；

与模型组相比较:#P<0.05,##P<0.01

生精小管数量也明显增多。松果菊苷高剂量组和阳性对照组生精小管密集、各层生精上皮细胞数量显著增多，生精上皮细胞层次趋于正常，生精小管内有大量成熟精子。

CON组 MODEL组 VC组

3 讨 论

肉苁蓉是著名的补益中药，在中国药典中就记载着它有滋补肾阳、补益精血的功效。在中药处方中，用于治疗阳痿、腰膝酸软、肠燥便秘等症[6]。松果菊苷是肉苁蓉的主要生物活性成分[7]，在抗氧化、抗肿瘤、保护神经、改善记忆力等方面效果明显[8]。近年来男性不育的发病率在不断升高，男性不育可能受生态环境、社会心理、生活方式等因素影响[9]。因此，我们采用松果菊苷治疗大鼠生精功能障碍，研究其改善作用。

前期研究显示[10]，连续7 d腹腔注射醋酸铅可以成功建立小鼠醋酸铅中毒模型。本研究应用该模型，采用低、中、高三个剂量观察松果菊苷对大鼠睾丸生精功能障碍的治疗作用。结果显示，松果菊苷可以提高精子数量、降低精子畸形率、提高精子活动率进而改善精子质量。LDH含量可以反映组织中细胞损伤程度，GSH和SOD水平不同程度的升高提示睾丸组织的抗氧化能力的提升。本研究中，应用松果菊苷干预后，睾丸组织氧化应激损伤情况得以改善，睾丸组织形态学损伤情况好转,提示松果菊苷对大鼠生殖损伤的治疗作用可能与降低氧化应激损伤、修复睾丸组织损伤有关。本研究通过体内实验，探讨了松果菊苷对大鼠生精障碍的作用效果，未来将深入研究相关信号通路蛋白的表达变化特点。