红光对酱油发酵品质的影响

林上飞,刘木清，2

(1.复旦大学工程与应用技术研究院，上海 200433；2.复旦大学先进照明技术教育部工程研究中心，上海 200433)

引言

酱油是一种以大豆和面粉为原料，并借有米曲霉等单种或多菌种长时间发酵得到的调味品。在酱油发酵过程中，米曲霉因其不产生毒素以及其分泌的丰富酶系，使其一直作为发酵关键菌种被广泛应用至今[1-4]。我国高盐稀态发酵酱油具有利用太阳光进行晒制发酵的特点。由于太阳光谱波段覆盖290～5 300 nm，对酱油发酵品质具有影响的光谱段和光照强度目前还没确定。目前，已有部分研究者从基因和蛋白质组学层面研究光照对米曲霉生长发育等的调控作用。赵国忠等[5]对我国常用菌株米曲霉3.042首次进行测序，明确其与模式菌株RIB40具有相当的同源基因。说明对不同型号的米曲霉之间的研究结果具有一定参考价值。Hatakeyama等[6]发现红光(610 nm)抑制米曲霉RIB40产孢子，但其后发现某工业生产用的菌株具有相反结果，说明红光的作用依米曲霉菌株而定，是非保守的。此外，2015年，Murthy等[7]发现荧光灯也会抑制米曲霉F6的生长和孢子的形成，而这一特点适用于避免酱油发酵中过多米的曲霉生长。2012年李学伟等[8]利用滤色片分别得到具有红外波段混杂的红光、绿蓝和蓝光，并用于研究单色光对酱油发酵品质的影响，但其温度没有恒定，因而温度作为主要影响手段对各理化指标的影响可能覆盖了光质造成的次要影响。因此，本文从酱油发酵性能出发，设置630 nm峰值波长和光量子通量密度为2 033 μmolm-2s-1的红光，探究其对米曲霉单菌种高盐稀态酱油发酵的品质影响，为优化酱油发酵工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1)菌种和原料。米曲霉 (aspergillus oryzae)沪3.042:石家庄市鼎鑫酿造食品科学研究所。大豆、面粉、食盐，均为市购。

2)主要仪器。立式高压灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；酱油制曲一体机：泉州中翔生物技术有限公司；恒温发酵罐：上海博赋玻璃仪器有限公司；低温恒温槽：江苏天翎仪器有限公司；干燥箱：上海慧泰仪器制造有限公司；分析天平：上海天美天平仪器有限公司；量子传感器：荷兰Kipp&Zonen公司。

3)主要试剂。福林试剂：天津市光复精细化工研究所；无水碳酸钠：北京博奥华医生物科技有限公司；三氯乙酸：复旦大学危险化学品管理中心；磷酸盐缓冲液：北京博奥华医生物科技有限公司；干酪素：天津市光复精细化工研究所；L-酪氨酸：北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠：复旦大学危险化学品管理中心；硫酸：复旦大学危险化学品管理中心。所有试剂均为分析纯。

1.2 方法

1)光照条件设置。在酱油的发酵过程中，往往需要避免米曲霉进一步消耗原料进行生长发育和产生孢子，使原料转化率下降，因此选取红光单色光LED芯片作为光源，峰值波长为630 nm，半峰宽为10 nm。而光照系统强度的设置则基于光合辐射PAR(photosynthetic active radiation)量子通量U与太阳辐射S估算关系式为[9]：

U=4.72ηPARS

(1)

其中，U为光量子通量密度(μmolm-2s-1)，ηPAR为太阳直接辐射中PAR能通量占全波段积分能通量S的比例。根据IEC891中太阳平均辐射强度1 000 W·m-2，以及7月份广州比例值为0.430[9,10]，可算得7月份广州平均光量子通量密度为2 030 μmolm-2s-1。

参考光谱组装算法及光量子通量密度检测方法[11-13]，实验室自制光照试验系统。对光照系统的光合光通量密度值进行调整，以最接近参考值，实测数据记录于表1。对照组为黑暗组。在实验期间，光照系统被固定于恒温发酵罐正上方，光照时长为10 h/d，发酵周期为60 d。

表1 实验组和对照组的参数设置Table 1 Setting of experimental group and control group

2)酱醪发酵的光照实验。成曲制备工艺：大豆与水按1∶1.2质量比进行混合，润水8 h，使大豆充分吸水至颗粒饱满无皱，121 ℃高压蒸15 min，并快速泄压，使大豆蛋白分子适度变性。拌入大豆0.67倍(w/w)的面粉，待熟料冷却至35～37 ℃时，接入0.03%(w/w)孢子，混合均匀。按照通风制曲法进行培养，温度控制在30～35 ℃，培养至约第45 h，曲料至黄绿色后结束，获得成曲。成曲的质量以中性蛋白酶活力来表征。

参考我国传统高盐稀态发酵工艺和日晒夜露法，将成熟曲料与18°Bé盐水按1∶2.2(w/w)均匀混合，并发酵60 d。考虑到温度对酶系的活性起最主要影响，为避免光照的热量对酱醪产生明显的热效应，设置30 ℃恒温发酵。发酵期间定期进行淋浇。分别于发酵第4 d、第20 d和第60 d抽取并过滤得到粗原油，进行全氮、氨基酸态氮和总酸的测定。

3)指标测定。中性蛋白酶活力的测定依据SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》。全氮的测定依据GB/T 18186—2000《酿造酱油》。氨基酸态氮含量的测定采用GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》。总酸的测定按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》。可溶性无盐固形物含量的测定采用GB/T 18186—2000《酿造酱油》。

4)数据分析。所有检测均重复三次，结果表示为平均值±标准偏差。使用GraphPad Prism8进行数据分析。采用F检验以判断数据的方差齐性，采用T检验分析数据间的差异性。

2 红光对酱油原油品质的影响

对酱油的成曲进行中性蛋白酶活力检测，结果显示中性蛋白酶平均活力为1606±98.0 U/g，表明米曲霉3.042菌株能正常分泌水解酶，该成曲可用于酱油的晒制发酵。将成曲等分并分别进行为期2个月的发酵，结果记录于表2和图1～图3。我国酱油国家标准以全氮、氨基酸态氮和可溶性无盐固形物三个指标对酱油品质进行等级划分。下面分别就全氮、氨基酸态氮、可溶性无盐固形物和总酸进行分析。

表2 第60天原油检测结果Table 2 Results of soy sauce on day 60

1)全氮分析。全氮代表原油中含氮物质如可溶性蛋白、多肽和氨基酸等的总量。从图1可以看出，全氮含量在前20 d发酵期间迅速提高，随后增速稍缓。整个发酵期间，全氮总量一直在逐渐上升。在第60 d时，红光组的全氮值比对照组高18%，并且两者间具有极显著差异。因此，在发酵60 d内，2 033 μmolm-2s-1强度的红光可加速全氮的积累，可能对原料大分子蛋白的水解反应具有某种影响。此外，分别参照国标等级划分标准，红光组的全氮含量满足特级指标(≥1.50 g/100 mL)，而对照组则处于一级指标(≥1.30 g/100 mL)。

图1 全氮含量随时间的变化Fig.1 Changes of total nitrogen content with time

2)氨基酸态氨和可溶性无盐固形物的分析。氨基酸态氮为酱油原油中含氮的氨基酸量，一般标志着酱油的滋味。其含量越高，说明当前原料的水解反应越彻底，有更多的呈味氨基酸生成。从图2可以看出，氨基酸态氮含量随着发酵时间迅速增加，其中前20天的增速最大。第60 d时，红光组的氨基酸态氮含量比对照组高出12%，具有统计学差异。与李学伟等[8]的做无光控温发酵60 d得到的原油中的氨基酸态氮含量接近。因此，在发酵60 d内，2 033 μmolm-2s-1强度的红光可加速全氮中的中间产物如可溶性蛋白和多肽等进行水解反应，产生氨基酸，使氨基酸态氮含量快速上升。此外，根据国标等级要求，第60 d时，红光组和对照组的氨基酸态氮含量均满足特级指标(>0.80 g/100 mL)。红光组的可溶性无盐固形物比对照组高14%，两组间具有显著性差异，且均满足特级指标(>15.00 g/100 mL)。

图2 氨基酸态氮含量随时间的变化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen content with time

综合全氮、氨基酸态氮和可溶性无盐固形物三个指标，红光组均高于对照组，且满足国标特级指标，而对照组满足一级指标。因此，2 033 μmolm-2s-1强度的红光晒制发酵得到的酱油品质更优。

3)总酸分析。除了丰富氨基酸呈现的滋味，以乳酸为主的有机酸类带来的酸味也是酱油一种重要的呈味成分。酱油中的总酸，代表酱油中含有的乳酸、醋酸、柠檬酸和琥珀酸等各种有机酸的总量。由于酱油日晒夜露酿造工艺的开放式环境，酱醪不可避免会引入空气中各种微生物，如乳酸菌、微球菌、酵母菌等。在酱醪发酵初期，特别是嗜盐性片球菌这些耐盐性的乳酸菌，其附着在酱醪表面生长繁殖，消耗双糖生成单糖。随后，单糖又进一步被消耗生成乳酸等有机酸，而有机酸的积累也使酱醪的pH逐渐下降。如图3所示，两组的总酸含量在第4 d时相近。随着发酵时间，两组的总酸含量差距逐渐增大，第60 d时，红光组的总酸比对照组高28%，两者具有极显著差异。另一方面，两组的pH均随发酵时间而逐渐降低。第60 d时，红光组的pH下降较快至4.73，与高盐稀态酱油发酵呈弱酸性的过程一致[14]。因此，2 033 μmolm-2s-1强度的红光相比黑暗条件更利于有机酸的积累，可明显提高总酸含量。具体的原因还有待下一步对生成有机酸的相关细菌进行探究。

图3 总酸随时间的变化Fig.3 Changes of total acid content with time

3 结论

2 033 μmolm-2s-1强度的630 nm单色光对米曲霉单菌种高盐稀态酱油光照60 d后，所得酱油原油的全氮、氨基酸态氮、可溶性无盐固形物和总酸相比黑暗条件级别分别提升18%、12%、14%和28%，均具有统计学差异。其中，全氨和总酸的差异为极显著。因此，采用2 033 μmolm-2s-1强度的630 nm单色光进行恒温酱油发酵优于无光恒温发酵，可促进原料如大豆蛋白分子的水解，促进可溶性蛋白、多肽和氨基酸等的积累，使酱油发酵性能得到提升，并具有缩短发酵周期的可能性。本文从酱油发酵性能的角度，初步探究一定强度的红光对米曲霉单菌种高盐稀态酱油发酵性能的影响，为优化酱油酿造工艺提供一些参考。

致谢：感谢佛山市海天(高明)调味食品有限公司童星等人对本研究的讨论。