海藻糖对糖尿病小鼠胰腺的保护作用*

王玲娥，张苗苗，王 甜，郭 霜，刘秀芬，余 薇，郑 萍

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院五官医学院；3.湖北科技学院临床医学院；4.糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室)

糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病，导致多器官损伤和各种并发症，危及患者健康。持续的高血糖会造成胰腺细胞损伤和凋亡，最终导致胰岛素分泌衰竭。研究发现[1]受损胰腺组织中自噬水平下降，而自噬水平升高对胰腺损伤具有保护作用。

海藻糖是非还原性二糖，对生物活性物质具有非特异性的保护作用[2]。现已证实海藻糖作为一种广泛分布于非哺乳动物和植物中的自噬增强剂，通过增强自噬的方式保护细胞免受损伤。研究发现海藻糖通过调节AKT和AMPK-SKP2-CARM1信号通路介导TFEB，增加自噬水平，最终提高随意型皮瓣存活率[3]。然而，海藻糖对糖尿病小鼠胰腺的作用及机制鲜有文献报道。本实验旨在通过建立糖尿病小鼠胰腺损伤模型，观察海藻糖对糖尿病小鼠胰腺自噬水平的影响，探讨海藻糖对糖尿病小鼠胰腺损伤的保护作用及机制，为临床上糖尿病胰腺损伤的防治提供新的理论依据和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60只SPF级雄性C57BL/6J小鼠购于湖北省实验动物研究中心[动物许可证号SCXK(鄂)2015-0018]，体质量20～25g。在室温20℃～25℃，12h昼夜节律的动物房中适应性喂养1周，自由饮食饮水。

1.1.2 药品与试剂

海藻糖(Trehaolse，Tre，S11052-100g)购于武汉汉宇飞扬科技有限公司；链脲佐菌素(S0130，Sigma)；AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、Beclin-1、LC3B、P62多克隆抗体购于Cell Signaling Technology。

1.1.3 主要实验设备与仪器

电子天平，多功能酶标仪(瑞士 Tecan Spark)，冷冻离心机(美国 Sigma)，电泳槽，转膜仪(美国 Bio-Rad)，化学发光成像系统(美国 Bio-Rad)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药方法

C57BL/6J小鼠连续5d腹腔注射链脲佐菌素(50mg/kg)，注射链脲佐菌素3d和7d后尾静脉取血测定血糖，连续2次随机血糖≥16.7 mmol/L者视为糖尿病模型建立成功。糖尿病小鼠随机分为模型组(n=15)和海藻糖治疗组(n=15)。另设正常对照组(n=15)和海藻糖对照组(n=15)，对照组小鼠给予腹腔注射等容量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液5d。

正常对照组和模型组小鼠每隔一个月连续2d均腹腔注射等量超纯水，再给予正常饮食饮水，海藻糖对照组和海藻糖治疗组每隔一个月连续2d腹腔注射海藻糖1mg/(g·d)，再给予2%海藻糖饮水给药24周[4]。

1.2.2 小鼠胰腺重量和脏器系数的测量

小鼠称体质量后麻醉，摘除眼球取血处死，立即取其胰腺，用生理盐水洗净并用滤纸吸干胰腺表面液体后称重，根据公式：脏器系数=脏器重量/体质量，计算小鼠胰腺重量系数。

1.2.3 Western Blot法测定蛋白表达变化

胰腺组织中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液后研磨匀浆，在冷冻离心机中以12000r/min离心15min，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。电泳转膜后敷育相应的抗体，使用化学发光仪进行底物显色，应用Image Lab软件进行灰度值分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 海藻糖对糖尿病小鼠胰腺重量和脏器系数的影响

与正常对照组相比，模型组、海藻糖治疗组小鼠胰腺重量显著性降低(P<0.05)，胰腺重量系数升高，但没有显著性差异；与模型组相比，海藻糖对照组小鼠胰腺重量显著升高(P<0.05)，海藻糖治疗组小鼠胰腺重量无变化(P>0.05)。海藻糖对照组的胰腺重量和胰腺重量系数与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 海藻糖对糖尿病小鼠胰腺重量和脏器系数的影响

2.2 海藻糖对糖尿病小鼠胰腺自噬蛋白表达的影响

与正常对照组相比，模型组Beclin-1、LC3B蛋白表达水平显著降低，p62蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，海藻糖治疗组Beclin-1蛋白表达水平升高，p62蛋白表达水平降低(P<0.05)，LC3B蛋白表达水平有升高趋势，但是无显著性差异(P>0.05)。海藻糖对正常小鼠胰腺自噬蛋白没有作用。见图1。

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.3 海藻糖对糖尿病小鼠胰腺AKT/GSK3β信号通路蛋白表达的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠胰腺p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比值降低，海藻糖治疗后p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比值升高(P<0.05)。海藻糖对照组p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比值与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。见图2。

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨 论

糖尿病是以高血糖为特征的可导致各种并发症，危及患者健康的一种内分泌代谢性疾病。糖尿病引起的自噬异常、代谢紊乱、氧化应激、胰岛素抵抗都会造成组织损伤。胰岛是位于胰腺外分泌部之间的球状细胞团，糖尿病导致胰岛β细胞凋亡增加，进而导致胰腺组织损伤。本实验结果显示糖尿病小鼠胰腺重量减少(P<0.05)，这与相关文献[5]报道一致。

自噬是真核生物细胞经溶酶体清除自身受损细胞器完成细胞自我更新的过程。有文献报道高浓度葡萄糖抑制自噬水平，而自噬水平的升高对高浓度葡萄糖损伤的细胞具有保护作用。在高浓度葡萄糖损伤的神经细胞中发现了自噬的降低，海藻糖逆转高浓度葡萄糖诱导的异常自噬。进一步研究表明高浓度葡萄糖损伤胰腺组织中的胰岛β细胞，抑制胰腺组织的自噬水平，导致细胞凋亡，最终导致胰岛β细胞功能受损和胰岛素分泌减少，而自噬水平的升高减轻了胰腺损伤[6]。海藻糖是自噬增强剂，其诱导自噬发生。为了研究海藻糖是否通过诱导自噬对糖尿病小鼠胰腺发挥保护作用，我们对自噬蛋白进行了测定。数据表明糖尿病胰腺中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B表达水平明显降低，p62表达水平明显升高，而海藻糖治疗逆转这一现象，证明高糖水平抑制自噬发生，而海藻糖的治疗减轻了自噬异常。综上所述，说明海藻糖可以通过增强自噬对糖尿病胰腺发挥保护作用，但是其保护作用的深层机制尚未明了。

AKT调节细胞存活、增殖、凋亡和血管生成等生理进程。AKT通过抑制下游底物GSK3β保护细胞免受氧化应激、凋亡、自噬异常的损伤。文献报道[7-8]，AKT/GSK3β信号通路的激活可以保护心肌细胞免受缺氧诱导的细胞凋亡，增加肝细胞内糖原含量从而改善HepG2细胞的胰岛素抵抗状态。Huang等[9]认为AKT1/GSK3β同工型信号转导轴在胰岛β细胞复制和存活中起关键作用，AKT1/GSK3β信号通路促进分泌胰岛素的β细胞再生是糖尿病治疗的新型方法，有助于治疗高血糖症。此外，研究表明AKT/GSK3β信号通路调控自噬水平进而发挥细胞保护作用[10]。因此，我们猜想海藻糖可通过激活AKT/GSK3β信号通路增强自噬来对糖尿病胰腺发挥保护作用。本实验数据显示模型组p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比值显著性降低，海藻糖治疗后p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比值显著性升高，这说明海藻糖通过激活AKT/GSK3β信号通路对胰腺损伤发挥保护作用。

综上所述，糖尿病可导致小鼠胰腺重量减小，自噬水平降低以及AKT/GSK3β信号通路抑制。海藻糖通过激活AKT/GSK3β信号通路增加自噬水平进而对糖尿病胰腺发挥保护作用。深入研究海藻糖对糖尿病胰腺损伤的深层机制将为临床治疗提供新思路。