无机氮源在枯草芽孢杆菌补料分批发酵核黄素中的作用

2020-09-11张梦雪王学东

华东理工大学学报(自然科学版) 2020年4期

尉文，张梦雪，王学东

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

核黄素（Riboflavin）又名维生素B2（VB2），它是生物体内重要的辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）的前体物质，这两种辅酶在氧化还原反应中作为电子受体，在生物代谢中起到重要作用[1]。核黄素常常用于医药和饲料添加剂、化妆品、食品等行业，其通常的合成方法为化学合成法和生物合成法[2-3]。随着生物工程的发展，微生物发酵法以生产工艺简单、原料廉价、环境友好以及资源可再生等优点逐步取代传统的化学合成法。

核黄素发酵的主要生产菌包括:棉阿舒氏囊霉（Ashbya gossypii）、阿舒氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii）、无名假丝酵母（Candida famata）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。目前，棉阿舒氏囊霉、无名假丝酵母和枯草芽孢杆菌等微生物已成功进行基因工程技术改造，并成功应用于核黄素的生产中[2]。相较于其他两种菌株，枯草芽孢杆菌具有很多优点，如原料要求低、发酵周期短、产量高等。因此目前核黄素主要通过基因改造过的枯草芽孢杆菌进行生产，且对该菌株的发酵过程进行优化和调节代谢通量也可以极大提高核黄素的产量[3-6]。

在过去的10 年里，核黄素的研究主要集中在对生产菌株基因的分子修饰方面，鲜有对生产过程中的代谢调控尤其是氮代谢调控的研究，但氮源在菌体生长和核黄素生产中作用重要[7]。

本文针对不同的无机氮源及其组合对菌体生长和核黄素产量的影响进行了详细的研究，并对补料分批发酵过程中铵离子浓度的调控策略进行了改进，以提高枯草芽孢杆菌发酵产核黄素能力。

1 材料与仪器

1.1 菌株

枯草芽孢杆菌，本文中使用的菌株由合作企业提供，该菌株已经过8-氮鸟嘌呤（8-AGr），氯霉素（Cmr），麦角霉素（Emr）和卡那霉素（Kanr）选育。

1.2 培养基

种子培养基 (g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，pH 7.0；

摇瓶发酵培养基 (g/L)：葡萄糖 100，玉米浆（干粉）20，酵母粉 5，无水 MgSO45，（NH4）2SO45，KH2PO41，K2HPO43，pH 7.0；

发酵培养基 (g/L)：葡萄糖 100，玉米浆（干粉）30，酵母粉 5，尿素 5，无水MgSO41，（NH4）2SO45，KH2PO41.5，K2HPO42.42，pH 7.0。

1.3 主要仪器

GZX-9070MBE 电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司；层析缸：上海楚定分析仪器厂；7 L 发酵罐：上海保兴生物有限公司；SBA-40D 型葡萄糖检测仪：山东省科学院生物研究所；UV2800 型紫外可见分光光度计：UNIC 公司；Centrifuge 5415D/5804R：德国Eppendorf 公司。

2 实验方法

2.1 培养条件

种子培养条件：摇床温度控制在40 ℃左右，转速控制在180～200 r/min，培养时间36 h；

摇瓶培养条件：接种量2%，培养温度40 ℃，pH 7.0～7.2，转速为180～200 r/min，培养周期48～60 h，结果重复3 次；

发酵培养条件：接种量2.5%，培养温度40 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧20%以上，转速与溶氧联动，发酵36～48 h。

2.2 分析方法

2.2.1 菌体浓度（Cell density）菌体浓度用吸光度值(OD) 表征，OD 值采用紫外-可见分光光度法测得：在600 nm 下测吸光度值（即OD600），一个单位的OD600对应0.38 g 细胞干重。

2.2.2 核黄素测定取发酵液用0.05 mol/L 的NaOH溶解20 min，在10 000 r/min 下离心3 min，上清液在444 nm 下测定吸光度值（A444），核黄素产率用A444除以0.064 2 来表示，单位为IU/mL。

2.2.3 铵离子浓度检测方法采用苯酚-次氯酸法检测铵离子浓度，首先将2.5 mL A 溶液（浓缩苯酚62 g，硝基铁氰化钠25 g，定容为1 L，将其置于棕色瓶储存在冰箱中）加入离心管中，然后加入20 μL 样品，最后加入B 溶液（氢氧化钠50 g、次氯酸钠2.1 g，定容为1 L）。将混合溶液在37 ℃下水浴20 min，测量上清液在630 nm 处的吸光度值（A630），氨离子浓度（cNH+4，mmol/L）由计算公式A630= 0.084 8cNH+4+ 0.045 9(R2=0.999 5)得出[8]。

3 结果与分析

3.1 不同氮源对菌体生长和核黄素产量的影响

根据玉米浆（西王集团有限公司）和安琪酵母粉（安琪酵母股份有限公司）成分分析表，在初始培养基中，玉米浆中有机氮源质量分数为4.58%，安琪酵母粉中有机氮源质量分数为7.76%，尿素中有机氮源质量分数为46.7%，所以在初始培养基中，有机氮源质量分数为26.96%，无机氮源质量分数为10.6%，对于有机氮源来说，成分复杂且影响因素较多，本文数据仅作参考。

为探究不同氮源对菌体生长和核黄素产量的影响，本实验将初始的发酵培养基作为空白对照组，随后添加几种常见氮源进行研究。有机氮源选择酵母粉和尿素，根据实验室前期培养基优化情况，添加了5 g/L 酵母粉和3 g/L 尿素；无机氮源选择硫酸铵和硝酸钠，使其浓度均为0.05 mol/L。发酵60 h 之后测定菌体浓度和核黄素产量，结果见表1。从表1 中可以发现，对照组OD600为12.4，产量为677 IU/mL，添加酵母粉和硫酸铵的实验组中菌体浓度比其他实验组高，相较于对照组，分别提高了35%和22%，但两个实验组的核黄素产量较低；添加了尿素和硝酸盐的实验组中，与对照组相比，核黄素产量有较明显的增加，分别提高了15%和19%，而尿素对菌体生长的作用不明显，硝酸钠有一定的抑制现象。通过此实验可以推测铵盐对于菌体生长有促进作用，硝酸盐对核黄素生产有促进作用，在培养基中可寻找二者最佳配比，此比例下既有利于菌体生长又有利于核黄素生成。

表1 不同氮源对生物量以及核黄素产量的影响Table 1 Influence on the biomass and the yield of riboflavin under different nitrogen sources

3.2 不同质量浓度硝酸钠对核黄素产量影响

从实验结果（表1）中发现，硝酸盐对核黄素合成的促进效果最明显，因此对培养基中硝酸盐的质量浓度进行优化，摇瓶发酵60 h 后测定菌体浓度和核黄素产量，结果如表2 所示。在培养基中添加不同质量浓度的硝酸钠对核黄素产量有不同程度提升，最高可达到832.5 IU/mL，相比于对照组的652.0 IU/mL提高了28.0%。从表中还可以看出，硝酸钠最适质量浓度约为10 g/L。

3.3 铵离子、硝酸根离子的混合比例对核黄素产量影响

为了寻找铵盐和硝酸盐最佳比例，首先对比枯草芽孢杆菌在利用不同无机氮源过程中的菌体浓度、核黄素产量、 N H+4浓度以及 N O−3浓度的变化，确定氮原子的总浓度为0.1 mol/L，设计含有不同氮源组成的培养基（如表3），并对枯草芽孢杆菌进行培养，此过程控制其他成分不变，检测发酵过程中的pH，48 h 后测定菌体浓度和核黄素产量。3 种氮源对发酵影响如图1 所示，无机氮源对pH 的影响如图2所示。

表2 不同质量浓度硝酸盐对产量和菌体浓度的影响Table 2 Effect of different mass concentration of sodium nitrate on the yield and cell density

从图1 中可以发现，在培养基a 中 N H+4浓度迅速下降，菌体生长速度最快，36 h 达到最大菌体浓度（OD600约为18），说明 N H+4有利于菌体的快速生成。但就核黄素产量而言，培养基a 的产物产量是3 种培养基中最低的。培养基b 中的核黄素含量比a 中的高，说明 N O−3在核黄素生产过程中对产量提升有重要作用，但菌体的生长在一定程度上却受到抑制，生长状况与培养基a 相比略显滞后。另外在培养基c 的培养过程中， N H+4和 N O−3离子浓度同时降低，这说明了枯草芽孢杆菌对 N O−3利用不受 N H+4抑制，在生长期尽管菌体比生长速率没有培养基a 的高，但比仅使用NaNO3作氮源的培养基b 的生长情况改善明显。从产量上来说，培养基c 的核黄素产量是最高的，最大产量为812 IU/mL，相比培养基a 和b，核黄素产量分别提高了35%和14%。

对上述实验结果进行分析，铵离子在氮的代谢中具有重要作用，铵离子浓度适当时有利于核黄素的生产。第一，铵离子可促进谷氨酰胺合成，而谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷（GTP）合成所需的物质可促进GTP 的生产，而GTP 又作为核黄素生产的直接前体有利于核黄素的积累。铵离子在依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的谷氨酸脱氢酶GDH（NADPH-GDH）的作用下可以与三羧酸循环（TCA）中α-酮戊二酸生成谷氨酸，接着在谷氨酰胺合成酶（GS）作用下与谷氨酸再次反应生成谷氨酰胺[10-11]。谷氨酸合酶是由GLN1 基因编码，在氨水平低的条件下才表达。氮源受到限制会使编码GS 的基因去阻遏，从而激活GS 活性；当氨水平升高时则相反[12]。文献[13]研究发现嘌呤短缺时GS 可以去阻遏，虽然具体机理了解还不透彻，但是谷氨酰胺作为嘌呤核苷酸的前体物质，可能影响其合成。第二，铵离子对菌体生长和异化代谢更加有利。谷氨酸含量与铵离子浓度成正相关，作为一种容易被利用的氮源，氨和谷氨酸主要通过氮代谢和糖酵解（EMP）、TCA 等途径发挥作用，因此容易引起代谢发生迁移，同时也影响到依靠磷酸戊糖途径（PP）进行表达的核黄素的生成。从本次实验中也可以发现相似的规律：高浓度的铵离子对PP 途径代谢会产生一定的抑制作用，降低核黄素产量，而适宜的铵离子浓度有利于核黄素生产。

表3 不同氮源组成的培养基中 N O−3 和 N H+4 的组合情况Table 3 Composition of N O−3 and N H+4 in different nitrogen sources media

图2 无机氮源对pH 的影响Fig.2 Effect of inorganic nitrogen source on pH

硝酸盐可以促进核黄素生产的原因可分为两个：首先，硝酸盐作为非速效氮源，在硝酸盐还原酶的作用下经过一系列反应生成氨，而被微生物所利用，这一水解速率与菌体同化速率相匹配，使铵离子的抑制效果降低，减少了代谢迁移现象的发生，促进产物积累；其次，硝酸根离子通过影响pH 来实现对于菌体生长和核黄素产量的调控。从图2 中可以看出，硫酸铵的加入会造成产酸加剧，整个发酵过程，pH 最低降至2.6，发酵结束时pH 约为5。而加入部分硝酸钠或者只添加硝酸钠的实验组中，pH 比加入硫酸铵组更高，最高可达到将近7.0，该pH 条件更加适宜菌体生长和产物合成。NaNO3属于生理碱性盐，当硝酸根作为氮源被利用时，会产生OH-，使环境中pH 升高，降低过度产酸对菌体的损害。硝酸盐释放的生理碱性物质可以中和铵盐被利用过程中产生的生理酸性物质，起到维持pH 稳定的作用，防止pH 剧烈波动影响菌体内酶的活性和正常生理代谢的速度。此外，根据武秋立等[14]的研究发现，影响核黄素形成的最后一个关键酶（核黄素合酶）的最适pH 在微碱性范围内。从上述结果（图2）可以看出，pH 对菌体生长和产物合成所起的作用不容忽视，具体对代谢过程中各种酶的影响有多大还有待于进一步研究。

在保证总无机氮相等条件下，进一步针对铵盐和硝酸盐的不同配比进行过程研究，含有铵盐比例越高，菌体生长越快，而没有铵盐的培养基中菌体生长受到一定影响，表现出一定的滞后性。反之，增加硝酸盐的比例，核黄素的产量提高。由图1 可得，当硫酸铵与硝酸钠物质的量之比为1∶8（培养基c）时，核黄素的产量最高，为812 IU/mL，并能使菌体较快生长。

3.4 补料分批发酵过程中铵离子浓度调控

本文初步研究了无机氮源（主要是铵盐和硝酸盐）的不同配比对核黄素生产和菌株生长的影响，并从代谢角度分析了铵盐和硝酸盐影响调控的内在机制。从核黄素的结构中可以计算出氮元素质量分数与蛋白质平均含氮量（约16%）相近，所以在发酵过程中补加氮源是必要的。在工业生产中氨水是一种常用的无机氮源，其主要作用有两个：一是为菌体生长和产物合成提供氮源，二是调节pH。

在7 L 发酵罐中采用连续补料的形式使葡萄糖质量浓度维持在10 g/L 左右。结果表明，随着发酵的进行，培养基底料中铵离子被菌体消耗，随着耗糖产酸速率增加，用于调节pH 的氨水的用量也随之增加，从而也向发酵液中不断引入铵离子，导致发酵液中铵离子浓度也随之增加（图3），而过高的铵离子对于核黄素生产不利。导致这一现象的原因有3 个：第一，代谢流发生偏移，氨和谷氨酸在氮代谢过程中发挥着重要的作用，它们作为速效氮源可以被微生物优先利用。然而微生物同化 N H+4是一个消耗ATP 的过程，因此对能量的要求会加大，而能量的产生依赖碳源的利用，低的ATP 可以激活EMP 途径关键酶（磷酸果糖激酶，PFK）的活性，直接导致EMP 途径通量增加，用于生产核黄素的PP 途径代谢通量相对减少，代谢途径发生迁移。第二，抑制谷氨酰胺合成酶活性，降低前体物质供应。有研究[15-16]在鸟苷发酵中发现高浓度的铵离子会抑制谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，该酶可以催化谷氨酸合成谷氨酰胺，它是核黄素的前体物质之一，该物质合成过程受阻可能会影响产物核黄素的形成。此外，高浓度的铵离子通过氮的代谢还会生成一些非必需氨基酸（如谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸）和有机酸（如丙酮酸）[17-18]，这些非必需氨基酸（如丙氨酸（Ala），谷氨酸（Glu））会抑制GS 活性，加剧代代谢溢流，使产物核黄素的生产速率下降，造成物质和能量的浪费。

图3 氨水调节pH 对菌体浓度和产量的影响Fig.3 Effect of pH on cell density and yield by ammonia

为了避免发酵过程中铵离子浓度过高对核黄素产生的不利影响，本文在发酵过程中使用氨水和2 mol/L 的NaOH 交替调节pH（图4）。当发酵进行至16～18 h，铵离子浓度降至5～10 mmol/L 时，发酵过程也将这一范围作为调控依据。当铵离子的浓度随着pH 的调节再次升高，超过10 mmol/L 时，改用2 mol/L 的NaOH 调节pH；当铵离子浓度低于5 mmol/L时，改用氨水调节pH，36 h 之后发酵结果如图4 所示。将图3与图4 对比后发现，调控铵离子浓度使其始终维持在比较低的水平时，核黄素产量由4 791 IU/mL提高至5 292 IU/mL，同时调控前后菌体浓度变化不大。