宏基因二代测序技术对非结核分枝杆菌感染病原学诊断的价值

缪 青， 姚雨濛， 潘 珏， 鲍 容， 王青青， 李 娜， 陈燕琼， 金文婷， 张 尧， 苏 逸， 马玉燕， 黄英男， 胡必杰

复旦大学附属中山医院感染病科，上海 200032

随着经济和卫生条件的改善及工业化进程的加快，国内感染性疾病谱已发生根本性改变，从病毒性肝炎逐步过渡到以细菌、真菌感染为主的疑难复杂感染症。非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)作为除结核分枝杆菌以外的其他分枝杆菌类型，亚洲人群发病率已增长到约39.6例/十万人年，并且仍以每年19例/十万人年的速度增长[1]。在我国，NTM的发病率已逐渐超过结核病。前期临床数据[2]表明，约47%感染性疾病患者为分枝杆菌感染，而其中NTM约占50%，后者的发病率远远超出预期。同时，复旦大学附属中山医院NTM的确诊率仅为40%左右，据此推测二级医院及地方医院的诊断率可能更低。更为严峻的是，NTM感染具有用药方案复杂、疗程较长、疗效不佳、易复发等特点，成为比结核病更难治疗的疾病[3]。因此，精准快速的诊断是改善NTM感染临床预后的首要条件。

目前NTM感染的主要诊断方法仍为常规微生物培养法，但培养周期较长、培养阳性率低，为临床诊断带来挑战。宏基因二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技术作为一种新型DNA/RNA测序方法，一方面，较一代测序方法通量更高、测序速度更快；另一方面，通过随机引物扩增样本中的所有核酸序列，理论上能无偏倚地检测出所有潜在病原体。因此，mNGS对于早期诊断疑难感染病例具有重大意义，在临床中的应用越来越广泛。本研究通过比较常规微生物培养法和mNGS检出NTM的阳性率，探讨mNGS技术对NTM的诊断效能。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2018年9月至2019年12月复旦大学附属中山医院收治的183例疑似NTM感染患者病例资料及388例样本。纳入标准：临床特征符合NTM诊断；样本质量合格；检测质控合格。排除标准：患者拒绝送检相关体液样本；样本质量不合格；同期样本未送检传统病原学检查或病理检测；测序结果示质控不达标。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(No.B2017-193R)，所有患者均知情并签署知情同意书。

1.2 常规微生物学培养 杆菌培养采用BACTEC MGIT960系统、改良罗氏法; 结核分枝杆菌复合菌与NTM分群主要采用对硝基苯甲酸(PNB)生长试验, 辅以耐热触酶试验、28∀生长实验。

1.3 mNGS检测

1.3.1 样本处理和DNA提取 取0.5～3 mL患者痰液，经玻璃珠混合震荡后按照TIANamp Micro DNA Kit(DP316，天根生化科技有限公司，中国)试剂盒步骤提取DNA。

1.3.2 文库构建和测序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段大小，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher，美国)对DNA文库浓度进行质控分析，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制(RCA)生成DNB纳米球。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片,使用BGISEQ-500进行测序。

1.3.3 数据分析 测序数据下机后去除低质量和长度小于35 bp的数据以获得高质量数据，通过比对，将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除。去除低复杂度序列后与微生物大数据库比对，并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫进行分类排列。

1.3.4 mNGS阳性标准 解读标准参照既往研究成果[2]，通过覆盖度比例及排名界定阳性报告。灌洗液中，NTM属排名为前40以内，痰样本为前60，组织样本为前10。

2 结 果

2.1 一般资料 结果(表1)显示：183例NTM感染患者，共388例样本。其中男性92例，女性91例，平均年龄55岁。感染病科送检149例，占81.4%，其余送检科室分别为重症监护室、风湿科、呼吸科等。收治患者中，感染性疾病确诊患者为133例，占72.7%；在感染性疾病中，101例为肺部感染，占76.5%；感染性疾病的病原学确诊病例数为81例，占61.8%。

表1 183例NTM感染患者一般资料分析

续表

2.2 样本总体阳性率及检测时间比较 结果(图1)显示：388例样本中，通过常规培养法检测出NTM阳性为85例，占总例数的21.9%；mNGS检测NTM阳性为96例，占总例数的24.7%。2种方法总体阳性率差异无统计学意义(P=0.29)。96例mNGS阳性样本的检测周期为48 h，85例培养法阳性样本的平均检测周期为28 d，mNGS检测周期明显较短。

图1 常规培养法与mNGS总体阳性率比较

2.3 不同样本类型检测阳性率比较 结果(图2A)显示：388例样本中，各样本类型分布如下：组织90例，痰83例，肺泡灌洗液81例，血液64例，体液42例，其他28例。对于组织样本，培养法的阳性率明显低于mNGS检测法(7.8%vs27.8%，P<0.000 1)；对于痰液样本，培养法的阳性率明显高于mNGS检测法(56.6%vs22.9%，P<0.000 1)；而肺泡灌洗液，培养法和mNGS检测阳性率差异无统计学意义(30.9%vs40.7%)。

2.4 临床获益比较 结果(图2)显示：3个月的随访结果表明，mNGS 3个月内抗菌药物调整频率低于培养方法，差异有统计学意义(20.3%vs40.2%，P<0.05)；患者抗NTM治疗有效率与培养法差异无统计学意义(40.7%vs50.2%)。

图2 mNGS与常规培养方法的临床获益比较

3 讨 论

近年来，mNGS技术在感染病原学领域的应用价值受到了越来越多的关注和认可，宏基因测序由于其随机引物进行无差别的扩增，比传统检测方法具有更高的敏感性，是病原检测领域一项突破性的技术。目前，国内外针对此技术的临床应用已有初步成果[4-7]，包括病例报道、病例系列报道、大样本研究等，涉及骨关节感染、皮肤软组织感染、肺部感染、中枢神经系统感染等，研究结果均表明，mNGS对病原体的检出效能较传统检测方法优势明显。因此，将来mNGS可能颠覆传统病原体检测流程，成为主导性诊断方法。目前研究重点需转移到此技术的改进流程及相关科研成果。

但是，前期研究[1]表明，mNGS在分枝杆菌的检测效能方面具有明显不足，而且非结核分枝杆菌mNGS的检出率和传统方法相比无明显优势。针对此现象，本研究采用2种方法检测NTM病例样本，结果表明，NTM和传统培养法阳性率均不足50%，总体灵敏度较低。可能是送检样本如血液、拭子等本身的检测阳性率就极低，因此总体阳性率偏低。基于上述结果，本研究认为NTM的病原学诊断依旧是临床实践中的难点，即使有了mNGS方法的应用，NTM的阳性率并没有明显提高，mNGS技术未来需要针对此病原体作重点改进。

另外，尽管mNGS和培养法在NTM病原体检出方面差异无统计学意义，但是将各类样本进行分层分析的结果表明，2种方法对肺泡灌洗液、痰液、组织这3种样本的检出阳性率差异明显。其中，痰液采用培养法检测的阳性率较高，而mNGS在肺泡灌洗液及组织检测中的阳性率较高。此结果与前期研究[1]相呼应，即mNGS检测NTM的理想样本为肺泡灌洗液和组织，而痰液样本可能由于大量口腔定植菌占绝大比例，间接导致NTM的序列检出数量明显下降，从而降低mNGS的灵敏度。

本研究结果表明，目前mNGS在鉴定诊断NTM这种病原体方面，与传统培养相比较，灵敏度无明显优势。但是在2种检测方法阳性率相当的情况下，mNGS能在24 h内明确NTM及菌种，而传统培养方法最长45 d报阳，菌种鉴定则更久。因此，本研究关于临床获益的统计表明，mNGS诊断为NTM的患者，3个月内抗生素调整频率低于培养组。另外，虽然2组患者的抗NTM时间及3个月内病灶好转率无明显差异，本研究认为造成此阴性结果的原因是本研究团队对NTM的影像学及临床特征认识比较深入，漏诊率低，诊治大多较及时，因此，后期可招募其他医院及中心的患者，更加客观评估mNGS的临床获益。

如何改进mNGS技术，提高NTM的检测阳性率？目前认为，增加数据量可增加mNGS的灵敏度，目前的数据量为每个样本30 M序列数，如果测序深度加大到100 M时，可能会使灵敏度趋于100%。但是，加大深度会带来另一个问题：如何判读所测到目标序列的真阳性或假阳性，在增加灵敏度的同时，是否会降低特异度？这是该技术未来需要探索的问题。

在现阶段的技术水平情况下，本研究认为对于疑似NTM感染患者，如果经济条件许可，推荐送检mNGS，在快速明确诊断并获得菌种信息的同时，揭示可能的合并感染。另外，对于肺部NTM感染拟诊患者，推荐的样本送检优先级别分别为肺泡灌洗液>肺组织>痰液，送检痰液时尽量送检深部晨痰以提高阳性率。

本研究尚有不足之处，病例未进行NTM的PCR检测，目前NTM的核酸检测相对成熟，因此可以和培养法相互补充，提高检测阳性率。因此，如果改进传统方法检测流程，可使入组患者例数增多，研究结果及数据更具客观性。

综上所述，mNGS是一项具有前景的研究，但是在NTM的病原学检测领域尚有很多不足，需重点改进以促进此技术更好地应用于临床。