感染番茄斑萎病毒辣椒防御酶活性的变化

刘学辉， 陈小均， 李 淳， 何海永， 陈 文， 王莉爽

(贵州省农业科学院 植物保护研究所， 贵州 贵阳 550006)

辣椒(CapsicumfrutescensL.)是常见蔬菜，其风味独特、营养价值高，深受人们喜爱。目前，辣椒产业是贵州12大特色产业之一，是脱贫致富的重要产业。近年来，由番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)侵染辣椒引起的辣椒番茄斑萎病毒病，在贵州辣椒主产区的发生和危害日益严重[1]。辣椒感染TSWV后植株整体矮化并伴有黄化症状，叶片上出现褪绿条纹、黄色环纹、斑驳花叶或轮纹状环斑，叶片有黄褐色坏死斑点，茎上出现坏死的条纹斑，条纹从茎部开始逐步蔓延至枝端，成熟果实则产生黄化，并伴有同心环或褐色坏死条纹斑点。由于对农作物的危害严重，TSWV在世界十大重要植物病毒中排名居第2位[2]，是一种检疫性植物病毒。

TSWV属布尼亚病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病属(Orthotospovirus)[3]。1984年在我国广州首次发现TSWV危害花生，随后在烟草、辣椒及马铃薯等多种作物上发现TSWV[4-7]。自然条件下TSWV主要通过蓟马传播，也可通过机械摩擦、嫁接等方式传播。目前报道有9种蓟马可以传播 TSWV，其中西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)是导致TSWV在世界范围内大面积发生的主要媒介[8]。TSWV寄主范围广泛，可侵染82科1 000余种植物[9]，且其能够对烟草、马铃薯、番茄、辣椒及银莲花等作物造成毁灭性危害。

由于TSWV侵染会给辣椒产业造成严重经济损失，且其传播介体的防控比较困难，很难有效抑制病毒的传播，所以选育TSWV抗病性辣椒品种成为目前防治TSWV经济、绿色且有效的方法[10]。研究表明，利用某些防御酶类的含量或活性水平变化作为植物抗病性鉴定的生化指标，如超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等的酶活性变化与植物抗病性密切相关[11]。王莉爽等[12]2015年报道了贵州辣椒受到TSWV的危害，随着近年来贵州农业产业结构调整，辣椒种植面积增加，TSWV的发生危害也日益严重。但目前尚未见有关贵州主栽辣椒品种对TSWV抗性的研究报道。鉴于此，以贵州本地主栽辣椒品种遵义朝天椒、百宜辣椒及感病品种茄门甜椒等作为研究材料，采用ELISA法定期测定3个品种接种TSWV后叶片中SOD、POD、CAT、PAL和PPO 5种酶的酶活性，明确不同辣椒品种酶活性与TSWV间的关系，揭示防御酶活性对TSWV的抗性生理生化机制，以期为辣椒番茄斑萎病毒病绿色防控及分子育种提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1辣椒遵义朝天椒和百宜辣椒为贵州贵阳和遵义当地的主栽品种，实验室长期繁殖保存；茄门甜椒，市购。

1.1.2病毒感染辣椒番茄斑萎病毒的叶片经PCR鉴定后，摩擦接种并经枯斑分离保存至普通烟K326备用。

1.1.3试剂凡科维(Fankew)ELISA酶活性检测试剂盒，上海科兴商贸有限公司；PBS缓冲液，北京中检葆泰生物技术有限公司。

1.1.4仪器设备MultiskanGO酶标仪，Thermo Fisher Scientific Inc.。

1.2方法

1.2.1病毒接种液制备取1 g TSWV感病叶片，加少量600目石英砂，于2 mL PBS缓冲液中研磨成匀浆，无菌水稀释至 10 mL备用。

1.2.2试验设计根据辣椒品种设3个处理，分别为遵义朝天椒、百宜辣椒和茄门甜椒。在辣椒苗6片真叶展开时选取长势一致的植株，摩擦接种TSWV病毒汁液，每株辣椒接种3片叶，每个品种处理10株，3次重复，以接种PBS缓冲液的植株(健康)作为对照(CK)。用画笔蘸取匀浆沿叶脉摩擦叶片正面，接种3 h后用无菌水冲洗叶片并将植株移入防虫网培养。

1.2.3酶活性测定于接种前和接种后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d及15 d取样，放于-20℃保存备用。采用ELISA酶活性检测试剂盒，参照说明书，利用酶标仪在450 nm波长依序测定各处理的吸光度(OD值)，计算SOD、POD、CAT、PAL和PPO的活性。测定应在加终止液后15 min以内进行。

1.3数据统计与分析

采用Excel 2010和DPS 10进行数据的统计与分析。

2结果与分析

2.1过氧化氢酶(CAT)活性的变化

从图1看出，接种TSWV后，随时间延长3个辣椒品种的CAT活性均有不同程度的变化，叶片CAT活性的最大值均出现在接种后第7天。其中，遵义朝天椒和百宜辣椒的CAT活性均呈先升后降再升再降趋势，二者均在第1天时达第1个峰值，第7天时达第2个峰值，2个高峰分别较同期CK提高121.49%、100.25%和32.32%、20.39%，茄门甜椒的CAT活性呈先升后降趋势，在第7天时达峰值，峰值较CK提高87.69%。CAT活性与病情指数的线性方程为y=0.207 3x-0.010 8(R2=0.991 7)。

2.2苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的变化

从图2看出，TSWV接种后随时间延长3个辣椒品种的PAL活性均呈先升后降再升再降趋势，其最大值均出现在接种后第7天，且各测定时期均较CK高，说明接种TSWV对辣椒叶片的PAL活性具有诱导效应。遵义朝天椒和百宜辣椒叶片PAL活性二者均在第1天时出现第1个峰值，第7天时出现第2个峰值，2个高峰分别较同期CK提高112.56%、92.44%和59.21%、92.21%。茄门甜椒叶片PAL活性在第7天时出现峰值，较CK提高53.84%。3个辣椒品种CK的PAL活性基本保持稳定。PAL活性与病情指数的线性方程为y=0.178 4x-0.064 8(R2=0.990 4)。

2.3过氧化物酶(POD)活性的变化

从图3看出，接种TSWV后，随时间延长3个辣椒品种的POD活性均有不同程度的变化，其最大值均出现在接种后第5天，第15天时接近CK的水平。遵义朝天椒和百宜辣椒叶片在接种TSWV后，POD活性在第1天时出现第1个峰值，较同期CK提高88.34%和44.30%；在第5天时出现第2个峰值且达最高值，较同期CK提高96.75%和81.16%。在第7天后POD呈迅速下降趋势，而同期CK的POD活性则呈上升趋势，第15天时接毒辣椒和CK叶片的POD活性基本持平。茄门甜椒POD活性在第5天时达峰值，较同期CK提高88.82%；随着时间的推移，POD活性呈下降趋势，到第15天时与CK的POD活性基本一致。POD活性与病情指数的线性方程为y=0.128 7x-0.012 3(R2=0.990 7)。

2.4多酚氧化酶(PPO)活性的变化

从图4看出，接种TSWV后3个辣椒品种叶片各测试期的PPO活性均高于CK，说明TSWV侵染可增强辣椒叶片的PPO活性。遵义朝天椒和百宜辣椒PPO活性均呈先升后降再升再降趋势，二者均在接种第1天时出现第1个峰值，较同期CK提高99.69%和89.06%；第5天时出现第2个峰值，较同期CK提高154.41%和100.73%。茄门甜椒PPO活性呈先升后降趋势，在第1天时出现峰值，较同期CK提高124.64%，之后逐渐下降。3个辣椒品种CK叶片的PPO活性保持相对稳定。PPO活性与病情指数的线性方程为y=0.264 4x-0.033 1(R2=0.978 8)。

2.5超氧化物岐化酶(SOD)活性的变化

从图5看出，接种TSWV后3个辣椒品种叶片的SOD活性均呈先升后降趋势。遵义朝天椒和百宜辣椒在接种后1～5 d时叶片的SOD活性较同期CK高，第7天时接毒辣椒叶片和CK的水平基本一致；但是遵义朝天椒和百宜辣椒在第9天时出现1个峰值后逐渐下降，而百宜辣椒CK的SOD活性呈上升趋势，较接毒叶片高。茄门甜椒SOD活性在接种后1～9 d时较同期CK高，各时期的活性变化比较平稳，在第11天后与CK的SOD活性相差不大。SOD活性与病情指数的线性方程为y=0.277 4x-0.022 7(R2=0.998 6)。

3结论与讨论

研究选取对TSWV表现出不同抗性的3个辣椒品种，在接毒后定期测定SOD、POD、CAT、PAL和PPO 等5种与病原菌侵染相关防御酶的酶活性变化。研究结果表明：遵义朝天椒和百宜辣椒在接种TSWV后，CAT、PAL、POD和PPO活性出现2个峰值，而茄门甜椒仅出现1个峰值，可能是因为遵义朝天椒和百宜辣椒接种病毒后早期引起防卫反应出现1次峰值，随着酶促反应速度加快，催化诱导形成的酚类物质积累再次出现峰值，从而加强了防御能力；而茄门甜椒由于病毒的繁殖和侵染导致寄主细胞被破坏，从而刺激防御酶活性的提高，但酶诱导速度和强度均较主栽品种差，不足以抑制病毒侵入，所以感病茄门甜椒出现1次酶活性峰值。3个品种出现防御酶活性最高峰的时间一致，表明接种TSWV后对辣椒叶片有一定的影响，但品种不同防御酶活性强弱有差异，与孙红炜等[13]的研究结果相符。接种TSWV后3个辣椒品种叶片的SOD酶活性变化并不明显，与菊花[14]的研究结果不一致，表明不同作物抗性与防御酶活性之间存在一定的关系，但并不是所有酶活性变化趋势都一致。

毛莲珍等[15]研究发现，番茄品种感染TSWV后，3个自交系中SOD、POD、CHT和β-1,3-GA活性均高于CK，PPO活性低于CK，其中免疫品种(YNAU335)6种酶的活性均高于2个感病自交系。楚成茹[16]研究发现，经人工接种 TSWV后，渝辣 10号、渝椒 12号、渝椒五号、艳椒 425、早春、艳椒 11、艳椒 417和农世缨朝天椒等8种不同重庆主栽辣椒品种的抗病性差异很大。研究结果表明，感染TSWV后贵州主栽辣椒品种遵义朝天椒和百宜辣椒与茄门甜椒叶片的防御酶活性存在差异，说明植物防御酶活性与抗性相关。其中，PAL和PPO活性显著高于CK，与黑银秀等[17]的研究结果相符；CAT、POD和SOD活性呈先升后降趋势，且不同辣椒品种的防御酶活性变化幅度不同，与沈登荣等[18]报道黄胸蓟马取食致使不同辣椒品种防御酶活性逐渐上升的结果一致。表明，TSWV侵染使辣椒体内的各种防御酶活性显著升高，且CAT、PAL、POD和PPO活性与辣椒的抗病性呈相关趋势，与刘琳等[19-21]研究报道一致。但是SOD活性与辣椒抗TSWV的关系并不显著，与已报道的研究不一致，可能是受品种差异、取样部位和取样时间等因素的影响所致，其有待进一步深入研究。