辅助性T细胞在直肠癌发生和转移中的作用

吴一堔　曹华阳 李亚彤 刘佐萱 刘兰涛

摘要 目的：探討直肠癌中FOXP3+Treg细胞的比例变化，揭示辅助性T细胞在直肠癌中的作用。方法：收集临床标本，用流式细胞仪检测直肠癌组织、癌旁组织和正常组织的比例。结果：癌组织中辅助性T细胞的比例31.6%，较癌旁组织17.8%明显增高。结论： FOXP3+Treg 细胞直肠癌组织中高表达，直肠癌的发生和发展有重要关系。

关键词： 直肠癌;辅助性T细胞;肿瘤转移

在我国结直肠癌的发病率和死亡率位居肿瘤第五。结直肠癌的发生和发展受到肿瘤缺氧微环境的调控，免疫耐受和免疫逃逸在其中发挥重要作用。有报道指出调节性T细胞通过抑制有效的抗肿瘤免疫应答而促进多种癌症的恶性进展。在癌症病人的肿瘤微环境中会浸润大量辅助性T细胞，系统性敲除机体FOXP3+Treg细胞会增强自身效应性T细胞的活化及功能和固有性免疫应答。

材料和方法

1.1收集临床标本：收集直肠癌确诊病例标本，年龄18岁以上，经病理诊断直肠癌的，手术过程中收集癌组织和癌旁组织新鲜标本，提取单个核细胞，用于facs检测。IL-10、CTLA-4、CD4+等抗体均购于 eBioscience。

1.2 流式细胞检测：采用密度梯度离心法富集淋巴细胞，流式分析其中FOXP3+Treg 细胞比例及其分泌的抑制性细胞因子CTLA-4 的变化。取调整好的细胞悬液 100微升 ，按试剂盒说明操作，加入一抗，二抗，用1%的多聚甲醛300μl重悬固定，24小时内上机检测。

1.3统计分析：应用 SPSS 25. 0分析数据，以 均数 ± 标准差计量。成对组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析 （ ANOVA） 检验，P  < 0. 05 表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1直肠癌与癌旁组织中 FOXP3+Treg 细胞比例变化

流式细胞检测结果显示FOXP3+Treg 细胞在大肠癌组织中高表达，癌组织中FOXP3+Treg 细胞的比例为36.1%，明显高于癌旁组织中FOXP3+Treg 细胞比例18.7%和正常对照组织中的FOXP3+Treg 细胞比例

2.2FACS 分析 FOXP3+Treg 细胞内抑制性受体 CTLA-4 的表达情况

流式细胞检测结果显示癌组织内FOXP3+Treg细胞内CTLA-4受体 大肠癌组织中表达明显增高，癌组织中FOXP3+Treg 细胞内CTLA-4受体比例为54.5%，明显高于癌旁组织中FOXP3+Treg 细胞内CTLA-4比例16.8%。

讨论

本课题研究直肠癌发现，与正常组织、癌旁组织相比，癌组织中辅助性FOXP3+Treg细胞比例显著上调 。这与其他学者研究的非小细胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌组织中较癌旁组织FOXP3+Treg浸润程度明显增高的结论一致，提示辅助性FOXP3+Treg细胞在结直肠癌抗肿瘤免疫反应中可能发挥重要作用。

Koch等学者研究发现，FOXP3+Treg细胞中的一个亚群可以表达Th1其趋化因子受体CXCR3和关键转录因子T-bet。大多数CXCR3+T-bet+FOXP3+Treg可更高水平的表达免疫抑制性受体CTLA-4和抑制性细胞因子IL-10。FOXP3+Treg细胞的高表达对由Th1介导的I型免疫反应中FOXP3+Treg的稳态和迁移能力也起到至关重要的作用，如T-bet+FOXP3+Treg细胞可聚集并调控由Th1介导的I型炎症反应。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞可通过抑制免疫细胞的抗肿瘤作用而提高自身的增殖能力和转移能力。

本研究发现，肿瘤微环境可明显上调免疫抑制性受体CTLA4的表达，有可能是由于FOXP3+Treg细胞内T-bet的蛋白水平上调引起的，此外，由此我们分析结直肠癌的缺氧微环境参与调控T-bet+Treg细胞比例及其免疫抑制功能。

然而肿瘤微环境是如何引起FOXP3+Treg 细胞比例上调的现在还不是特别清楚。 Yuan 等在乳腺癌细胞中发现，DNA 损伤会引起USP10 蛋白入核增多，可使得P53 蛋白去泛素化增多，达到稳定P53 的功能。我们猜测缺氧是否也会引起USP10 的入核增多，从而稳定T-bet 。我们根据前期的实验结果和相关文献猜测肿瘤微环境引起 FOXPTreg 细胞内 T-bet 的基因的水平变化，引起 USP10 表达上调，我们认为直肠癌缺氧的微环境可使 USP10 入核增多并稳定引起 T-bet 蛋白，从而上调 T-betFOXP3Treg 细胞比例。缺氧诱导因子（ HIFs）在细胞缺氧时维持胞内氧平衡并促进细胞适应低氧环境而存活。在缺氧环境中，肿瘤细胞主要通过 HIFs 激活一系列适应性基因来保证自身存活，HIF1α 和 HIF2α 在其中发挥重要作用。

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