响应面法优化魔芋葡甘露聚糖制备工艺及其理化性质分析

王瑶，宁杰，宋庆贺，张宪党，丁文宇，王志斌，丁丽娜

（山东第一医科大学附属内分泌与代谢病医院（山东省内分泌与代谢病研究所），山东济南250062）

魔芋（Amorphophallus konjac）为天南星科魔芋属的多年生草本植物。魔芋在我国分布广泛，从陕西、甘肃、宁夏至江南各省区都有分布，其主要生于疏林下、林椽或溪谷两旁湿润地区。我国不同地区对其俗称不同，如江西称其为灰草，云南称其为花麻蛇，陕西称其为花杆莲、麻芋子等[1]。我国是最早栽培和食用魔芋的国家，早在宋代《开宝本草》就有魔芋的记载。现代研究表明，魔芋具降血脂、降血糖、减肥[2]、排毒通便[3]、免疫调节[4]等作用。

众所周知，膳食纤维与糖、蛋白质、脂肪、水、矿物质和维生素并称为第七大营养元素，而魔芋正是膳食纤维含量较高的植物之一。研究发现魔芋膳食纤维是目前发现的最优良的可溶性膳食纤维，其主要成分是葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM），并且具有重要经济和保健价值[5]。KGM是由D-葡萄糖和D-甘露糖以β-1，4糖苷键链接的杂多糖，它具有强吸水性、高黏性、高膨胀性，以及良好的稳定性、增稠性、凝胶性等工艺特性，在食品工业、医药化工、纺织等领域有广泛的应用[6]。因此，开发出一种高品质、低成本且适合于工业生产的魔芋葡甘露聚糖制备工艺具有重要意义。

关于魔芋葡甘露聚糖的提取研究早在1922年就有报道，目前高纯度魔芋葡甘露聚糖的制备方法主要有乙醇洗脱法、生物酶法、酸水解法、超声辅助提取法等[7]。这些方法各式各样，也都取得了较好的效果，然而仍存在引入有机及化学试剂、难以工业化生产等问题，尤其是对KGM分子结构的破坏影响少有报道[8]。因此，本研究以新鲜魔芋为原料，采用响应面法对高纯度KGM制备工艺进行优化，并研究分析其持水力、膨胀力、持油力、阳离子交换能力功能性质，通过电子显微镜扫描、红外光谱分析和X-射线衍射分析测定其结构，为魔芋KGM的进一步合理开发与利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

魔芋品种为白魔芋，采自重庆市；淀粉酶（40 000 U/g）：索莱宝生物科技有限公司；无水乙醇、碘化钾、硫酸铜、盐酸、石油醚等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

全自动凯氏定氮仪（2300型）、样品消化炉（2006型）：瑞典FOSS.TECATOR公司；紫外-可见分光光度计（UV-2550型）：日本岛津公司；高速离心机（3K30）：sigma公司；电子天平（SQP）：赛多利斯科学仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet710）：美国尼高公司；热场发射扫描电子显微镜（SUPRATM55）：德国蔡司公司；锐影X射线衍射仪（EMPYREAN）：荷兰PANalytical公司。

1.3 试验方法

1.3.1 魔芋基本成分检测

取新鲜魔芋块茎，洗净、去皮，切片后参考食品安全国家标准对魔芋中各基本成分进行检测：水分测定采用直接干燥法[9]；灰分检测通过灼烧后测定总灰分[10]；淀粉检测采用酸水解法[11]；蛋白质检测采用凯氏定氮法[12]；脂肪检测采用索式提取法[13]；膳食纤维采用酶-重量法[14]。

1.3.2 魔芋中葡甘露聚糖的提取流程

鲜魔芋→去皮、切片→50%乙醇打浆（重复3次）→离心（3000r/min，离心1min，弃上清液）→KGM粗品→70%酸性乙醇（pH 5.5）洗脱46 min→风干→KGM。

1.3.3 魔芋葡甘露聚糖含量及得率的测定

KGM含量测定方法参考国家标准GB/T 18104-2000《魔芋精粉》中方法，KGM得率计算公式如下：

1.3.4 单因素试验设计

通过预试验，选取洗脱时间、洗脱液pH值、乙醇浓度3个对KGM得率的影响比较明显的因素进行单因素试验，采用乙醇梯度洗脱法制备KGM，测定其含量并计算出得率，以确定响应面试验的水平范围。

1.3.5 响应面试验设计优化

在单因素试验的基础上，选择洗脱时间、pH值、乙醇浓度3个因素进行Box-Behnken试验设计，试验水平因素编码表见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

1.3.6 魔芋葡甘露聚糖的理化性质研究

1.3.6.1 KGM黏度的测定

参照GB/T 18104-2000《魔芋精粉》中方法，使用黏度计进行测定[15]。

1.3.6.2 KGM持水力性质分析

参照邓林等[16]方法，稍加改进。称取质量为m0的KGM加入到质量为m1的离心管中。加入10 mL蒸馏水后，将样品与其混匀。常温下密闭保存12 h，以5 000 r/min转速离心30 min，用滴管吸取上层水分，称量吸取水分后的离心管质量m2。每一样品平行测定3次，按公式（2）计算持水力：

1.3.6.3 持油力的测定

参考Yaich等[17]的方法并稍加修改，称取质量为m0的KGM加入到质量为m1的离心管中。加入食用油4.000 g，将样品与其混匀后于37℃水浴锅中密闭保存4 h，然后将离心管以5 000 r/min转速离心30 min，用滴管吸取上层油液，称量吸取水分后的离心管质量m2。每一样品平行测定3次，按公式（3）计算持油力：

1.3.6.4 膨胀力的测定

参照Benítez等[18]方法，稍加改动。称取质量为m的KGM置于10 mL带刻度的试管中并记录其体积V1。加入7 mL蒸馏水，混匀后置于4℃静置17 h，记录样品吸水后的体积数V2。膨胀力按公式（4）计算：

1.3.6.5 阳离子交换能力的测定

参照Chau等方法[19]，将称取的质量为m的KGM加入干燥的50 mL离心管中，加入20 mL盐酸溶液（0.1 mol/L），密封后于25℃下静置12 h，以5 000 r/min转速离心30 min，弃去上清液后用蒸馏水洗涤滤渣至滤液中不含氯离子。将滤渣转移至干燥的150 mL锥形瓶中，加入100 mL氯化钠溶液（5%），用磁力搅拌器搅拌30 min后，以酚酞为指示剂，氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）为滴定剂进行滴定，滴定至溶液变色且3 min不褪色为止，同时做空白试验。滴定样品消耗的氢氧化钠溶液体积为V1，滴定空白样所消耗氢氧化钠溶液体积为V0。阳离子交换能力按公式（5）计算：

1.3.7 扫描电子显微镜分析（scanning electron microscope，SEM）

将待测样品干燥后，取适量颗粒黏附在样品台上，在真空条件下镀金，之后用扫描电子显微镜在5 kV下扫描观察KGM表观形貌，并放大50、250、1 000、5 000倍对微观结构观察拍照[20]。

1.3.8 傅里叶红外光谱分析（Fourier transform-infrared spectrometer，FT-IR）

按照1∶50的质量比准确称取干燥的KGM样品与溴化钾粉末，在玛瑙研钵中充分混匀、研磨。用液压机压成透明薄片后在波长范围为4 000 cm-1～400 cm-1进行红外光谱扫描。扫描在25℃干燥条件下进行，同时在样品测定前扫描空气背景，并将结果扣除空气干扰[21]。

1.3.9 X-射线衍射分析（X-ray diffraction，XRD）

将KGM样品通过荷兰PANalytical公司的锐影X射线衍射仪进行检测，参照文献检测条件，并稍加修改为：靶型Cu，管压40 kV，管流 40 mA，扫描区域2θ角度为 5°～45°[22]。

1.3.10 数据分析

每个试验最少重复3次，结果以平均值±标准差的形式表示。采用软件ORIGIN2019b进行图表制作，Design Expert 10进行响应面试验设计及相应数据处理。

2 结果与分析

2.1 魔芋基本成分分析

新鲜魔芋基本成分的含量见表2。

表2 新鲜魔芋基本成分的含量Table 2 Contents of basic ingredients of fresh konjac %

由表2中检测结果可知，新鲜魔芋块茎中除去水分之外的主要成分为膳食纤维（12.05%）和淀粉（4.62%），脂肪含量较低。因此，魔芋富含膳食纤维，尤其是优质的水溶性膳食纤维，是制备膳食纤维的良好材料，这与文献报道一致[23]。

2.2 魔芋葡甘露聚糖制备单因素试验结果

2.2.1 乙醇洗脱浓度对KGM得率的影响

分别称取10 g KGM粗品于5个200 mL烧杯中，分别加入浓度40%、50%、60%、70%、80%pH5.5的酸性乙醇80mL，置于40℃水浴中磁力搅拌洗脱45min，抽滤，晾干后测KGM含量并计算得率。乙醇洗脱浓度对KGM得率的影响见图1。

图1 乙醇洗脱浓度对KGM得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of KGM

由图1结果可知，在一定的乙醇浓度范围内，随着乙醇浓度的升高，KGM提取率逐渐升高，在70%乙醇浓度后继续提高乙醇浓度出现下降趋势。其原因可能为在乙醇浓度低时，部分KGM解于水中流失，而浓度高的乙醇抑制KGM结构展开不利于杂质的洗脱，因此选择洗脱乙醇浓度为70%。

2.2.2 洗脱时间对KGM得率的影响

分别称取10 g KGM粗品于4个200 mL烧杯中，加入浓度70%pH5.5的酸性乙醇80 mL，分别置于40 ℃水浴中磁力搅拌洗脱 15、30、45、60 min，抽滤，晾干后测KGM含量并计算得率。洗脱时间对KGM得率的影响见图2。

图2 洗脱时间对KGM得率的影响Fig.2 Effect of time on the extraction rate of KGM

由图2结果可知，在一定的洗脱时间内，随着洗脱时间的延长，KGM提取率逐渐升高，在45 min后继续延长洗脱时间得率出现下降趋势。洗脱时间过短，不利于杂质的洗出；洗脱时间过长，可能会引起部分KGM降解，因此，选取洗脱时间为45 min。

2.2.3 洗脱液pH值对KGM得率的影响

分别称取10 g KGM粗品于4个200 mL烧杯中，分别加入浓度 70%pH 3.5、4.5、5.5、6.5 的酸性乙醇 80 mL，置于40℃水浴中磁力搅拌洗脱45 min，抽滤，晾干后测KGM含量并计算得率。试验结果见图3。

图3 洗脱液pH值对KGM得率的影响Fig.5 Effect of eluent pH value on the extraction rate of KGM

由图3结果可知，在一定的pH值范围内，随着pH值的增大，KGM提取率逐渐升高，在pH 5.5后继续增加pH值得率出现下降趋势。pH值过大或过小都不利于KGM的提取，表明pH值对KGM得率影响显著，因此选择pH 5.5的酸性乙醇为洗脱液，与有关文献报道的在弱酸性条件下可以提高KGM的洗脱纯度结论相一致[24]。

2.3 魔芋葡甘露聚糖制备响应面试验结果与分析

2.3.1 响应面试验结果

KGM响应面试验结果见表3。

表3 KGM制备响应面试验结果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental results of KGM

由表3结果可知，利用Design Expert 10.0软件对数据进行分析，得出KGM得率对pH值、提取温度和提取时间的二次多项回归方程为：

R=-27.832 5+0.576 93A+14.618 25B+0.118 88C-0.001 25AB-0.000 45AC-0.006 33BC-0.003 87A2-1.254 5B2-0.000 55C2

2.3.2 方差分析结果

KGM制备试验方差分析结果见表4。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表4方差分析结果可知，响应面模型的F=169.70、P＜0.0001（极显著）、失拟项 P=0.5017＞0.05（不显著），这表明该模型具有较高的显著水平，此试验方法具有较高可靠性，且其它非试验因素对KGM得率影响不大；模型的相关系数R2=0.995 4，校正相关系数R2adj=0.989 3，这表明此模型能较好地模拟各因素与KGM得率的关系且准确性较高；其中试验因素B、A2、B2达到极显著水平。总之，该模型方程可以很好的分析和预测不同条件下提取KGM得率的变化情况。

2.3.3 KGM制备各试验因素间相互作用的响应面和等高线结果

KGM制备各试验因素间相互作用的响应面和等高线结果见图4。

综合分析Box-Behnken试验结果可知，乙醇浓度、洗脱液pH值、洗脱时间对KGM得率的影响从大到小为：pH值＞乙醇浓度＞时间，其中pH值影响极显著（P＜0.01），乙醇浓度影响显著（P＜0.05）。交互项的影响从大到小排列依次为：pH值和时间＞浓度和pH值＞浓度和时间，其中pH值和时间交互作用显著（P＜0.05），其余不显著（P＞0.05）。

图4 各试验因素间相互作用的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots of interaction among test factors

2.3.4 KGM制备工艺条件的确定和验证

根据Design Expert 10.0软件预测结果可知，当制备工艺为用70.9%的乙醇，在pH值为5.67的条件下，洗脱46.2 min时KGM得率最高，可达36.85%。考虑实际生产情况，最终将优化条件修正为：乙醇浓度70%，pH值为5.5和洗脱时间46 min，在此条件下重复3次平行试验，KGM得率分别36.39%、36.54%和36.81%，平均值为（36.58±0.21）%，与预测值较为接近，表明该模型优化得到的KGM制备条件准确性及实际操作性较好。

2.4 魔芋葡甘露聚糖功能性质测定

KGM黏度、持水力、膨胀力、持油力、阳离子交换能力的测定结果见表5。

由表5可知，提取得到的葡甘露聚糖具有高黏性、强吸水性及高膨胀性，分别达到29500mPa·s、49.81g/g、18.77 mL/g；这与其排毒通便、降脂减肥功能密切相关。同时各功能性质指标与文献[15，24]报道相符，说明提取得到的葡甘露聚糖功能性质变化不大。

表5 葡甘露聚糖的功能性质（±s，n=3）Table 5 Functional properties of KGM（±s，n=3）

表5 葡甘露聚糖的功能性质（±s，n=3）Table 5 Functional properties of KGM（±s，n=3）

样品黏度/（mPa·s）持水力/（g/g）膨胀力/（mL/g）持油力/（g/g）阳离子交换能力/（mmol/g）葡甘露聚糖 29 500±800 49.81±1.04 18.77±0.18 1.430±0.02 0.254 0±0.01

2.5 魔芋葡甘露聚糖表观形貌

图5分别为KGM在50倍、250倍、1 000倍及5 000倍的扫描电镜图。

通过观察图5可以得知，KGM呈不规则球形，大小分布不均匀，将其中一个颗粒放大显微倍数观察，可以发现颗粒表面相对光滑，同时吸附有杂质，这与相关文献[25]报道一致。

2.6 魔芋葡甘露聚糖傅里叶红外光谱分析

KGM红外光谱图见图6。

图5 魔芋葡甘露聚糖扫描电镜图Fig.5 SEM photographs of KGM

图6 魔芋葡甘露聚糖红外光谱图Fig.6 IR spectrum of KGM

观察图6发现，其结果与文献报道一致[26]。在3386、2 926 cm-1和1 400 cm-1～12 00 cm-1等处的吸收峰均为多糖的特征吸收峰。在3 600 cm-1～3 200 cm-1处出现一较强宽单峰，此为羟基伸缩振动引起，说明KGM可能存在着较多的羟基及结合水分子[27-28]。在2 929.51cm-1处为C-H的伸缩振动；2 148.00 cm-1为叁键或累积双键特征吸收峰；1 645.12 cm-1处为分子内氢键特征吸收峰；在1 384.59 cm-1处为C-H的伸缩振动。在1 350 cm-1～1 200cm-1范围内的吸收峰为C-H的变角振动，是糖类的特征吸收峰[29]。1 154.45 cm-1处为C-O酯键特征吸收峰；在1 079.61 cm-1和1 023.79 cm-1处同样为多糖类的特征吸收峰，由C-O醇键伸缩振动引起；781.87、612.20、520.19 cm-1处为吡喃型糖环特征吸收峰[30]。

2.7 魔芋葡甘露聚糖的X-射线衍射扫描结果

图7为KGM的X-射线衍射图。

图7 魔芋葡甘露聚糖的X-射线衍射图Fig.7 X-ray diffraction pattern of KGM

由图7结果可知，样品衍射图谱总体呈现弥散状，说明样品以非晶态为主，与文献报道一致[31]。另在2θ角 14.8、24.2、26.4、29.9 °处有较弱衍射峰，说明样品中含有少量晶态成分，提取后的KGM含有大量的无定型区域，少量的结晶成分隐藏在其中。

3 结论

本文对魔芋葡甘露聚糖的制备、性质及结构进行了系统性的研究。首先，应用响应面设计法得到魔芋葡甘露聚糖提取工艺：将鲜魔芋用3倍量50%乙醇打浆后，离心、干燥，再用8倍量70%酸性乙醇（pH=5.5）洗脱46 min，真空干燥后得葡甘露聚糖。其次，对制备的魔芋葡甘露糖理化性质进行分析，其持水力为49.81 g/g、膨胀力 18.77 mL/g、持油力为 1.43 g/g、阳离子交换能力为0.254 mmol/g。扫面电镜图结果显示魔芋葡甘露聚糖为表面带有沟壑的颗粒状，红外光谱显示其具有多糖特征吸收峰，X-射线衍射显示其晶型结构以非晶态为主，并有少量结晶成分隐藏其中。其理化性质与文献报道相一致，这表明本提取工艺对魔芋葡甘露聚糖的结构及功能性质影响较小。