诺氟沙星磁分子印迹纳米粒子的制备及其富集分离

黄昭，李跑，曹亚男，李佳银，刘霞

（湖南农业大学食品科技学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

氟喹诺酮类抗生素（fluoroquinolones，FQs）是一类人工合成的广谱抗生素，其抗菌活性强、价格低，被广泛用于动物养殖中，若被长期使用，即使是低剂量，也易造成动物源食品中该抗生素的残留。残留的抗生素可通过食物链进入人体，引起一些不良反应，主要对肌肉、肌腱、骨骼和神经系统产生危害[1]，甚至有致癌、致畸、致突变的风险。

食品分析检测技术是保障食品安全的重要手段。因为食品基质复杂，氟喹诺酮类抗生素残留浓度低，大部分检测技术，如液相色谱（liquid chromatography，LC）、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、及高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLCMS）等[2-4]，在检测实际样品前需要对目标物进行富集分离，排除基质干扰，以提高检测的灵敏度和准确性。常用的富集分离方法如液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取（solidphase extraction，SPE）和固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）等技术，这些方法通常存在操作复杂、耗时长、有机溶剂用量大等缺点[5-10]。

分子印迹技术（molecular imprinting technology，MIT）是使模板分子与功能单体以共价键或非共价键结合，再通过聚合作用形成包覆配合物的立体结构，经过洗脱解离模板分子后，形成与模板分子空间构型相匹配的印迹孔穴，可对模板分子进行特异性识别和吸附[11-12]。而磁分子印迹纳米粒子（magnetic molecularly imprinted polymers nanoparticles，MMIPs NPs）兼具特异性和磁性，在选择性吸附目标物的同时可通过外加磁场快速与基质分离，具有制备简单、成本低廉、特异性强、可重复利用等优点[13-15]。

本研究以诺氟沙星（norfloxacin，NOR）为模板分子，利用多巴胺（dopamine，DA）在室温（25℃）弱碱性溶液中可进行氧化自聚合的性质，在氨基修饰的四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4@NH2NPs）表面合成了MMIPs NPs，其制备条件温和、耗时短、试剂用量少，制备的MMIPsNPs能被磁铁迅速吸附，为富集分离样品中的NOR及其后续检测提供了一种更简单、环保的新技术。

1 材料与方法

1.1 试剂

NOR、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、四环素（tetracycline，TC）标准品：上海源叶生物有限公司；磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）标准品：上海瑞永生物科技有限公司；六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）、乙酸：上海国药集团化学试剂有限公司；DA、四甲基氢氧化铵（tetramethylammonium hydroxide，TMAOH）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysiane，APTES）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris-base：美国VWR International有限公司。

1.2 仪器与设备

Multiskan GO 1510全波长酶标仪：芬兰Thermo Fisher Scientific Oy公司；DZF-6030A真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；KQ-100超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HNY-20017恒温摇床：天津欧诺仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 Fe3O4@NH2NPs的制备

将 10 mmol FeCl2·4H2O、18.5 mmol FeCl3·6H2O溶于100mL超纯水中，通氮除氧，水浴加热至85℃，滴加40 mL 2 mol/L NaOH溶液，在550 r/min转速下反应1 h，冷却至25℃后用磁铁吸附，再用超纯水反复冲洗至中性后真空干燥，黑色固体即为Fe3O4NPs。干燥后的Fe3O4NPs，经7% TMAOH活化后，用乙醇清洗5次。将0.8 g活化的Fe3O4NPs加入120 mL体积比为1∶1的乙醇-水溶液中混合均匀，水浴加热至40℃再加入3 mL APTES，通氮除氧，在350 r/min条件下反应10 h，冷却至25℃后用磁铁吸附，乙醇冲洗5次，60℃真空干燥，于4℃冰箱中保存备用。

1.3.2 MMIPs NPs的制备

1.3.2.1 NOR检测波长的确定

分别对Fe3O4@NH2NPs、NOR、DA，用酶标仪扫描紫外全波段光谱，确定NOR的最佳检测波长。

1.3.2.2 MMIPs NPs的制备

将500 mg的Fe3O4@NH2NPs加入100 mL体积比为1∶1的乙醇-水溶液（用Tris-HCl调节pH值至8.5）中搅拌均匀，转移至250 mL的烧瓶，25℃水浴，依次加入15 mg NOR、134 mg DA搅拌均匀，在300 r/min转速下反应2 h，用磁铁吸附固体，纯水清洗固体3次后用真空干燥。

1.3.2.3 NOR洗脱液的选择

分别用1 mmol/L NaOH、1 mol/L NaOH、体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液、体积比为97：3的乙醇-乙酸溶液与1 mol/L NaOH交替洗脱4种方法洗脱模板分子，各洗脱5次，再用纯水清洗3次。取20 mg MMIPs NPs吸附1 mL 0.1 mg/mL的NOR标准溶液2 h，检测上清液中NOR的残留量，考察洗脱液洗脱模板分子的能力，及MMIPs NPs再次吸附NOR的效果。

1.3.2.4 模板分子与功能单体物质的量比的确定

按照 1.3.2.2 的条件，固定Fe3O4@NH2NPs（500 mg）和NOR（15 mg）的添加量，改变NOR与DA物质的量比（NOR ∶DA=1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20） 制备 MMIPs NPs。取15 mg MMIPs NPs吸附1 mL 0.1 mg/mL的NOR标准溶液2 h，检测上清液中NOR的残留量，计算其吸附效率，确定最佳的NOR与DA物质的量比例。

1.3.2.5 Fe3O4@NH2NPs添加量的确定

按照1.3.2.4得到的最佳条件，固定NOR和DA的添加量，改变Fe3O4@NH2NPs的添加量（250、500、750 mg），制备MMIPs NPs。取一定量的MMIPs NPs吸附1 mL 0.1 mg/mL的NOR标准溶液2 h，检测上清液中NOR的残留量，计算其吸附效率，确定Fe3O4@NH2NPs的最佳添加量。

1.4 吸附时间对吸附效率的影响

准确称取9份4 mg MMIPs NPs于4 mL离心管中，分别加入1 mL 0.02 mg/mL的NOR标准溶液，于恒温培养振荡器中吸附，在吸附 10、20、30、40、50、60、80、100、120 min时取出，磁铁吸附后取上清液，检测其NOR的残留量，计算其吸附效率，考察吸附时间对吸附效率的影响。

1.5 MMIPs NPs用量对吸附效率的影响

分别准确称取 4、10、15、20 mg 的 MMIPs NPs于4 mL离心管，分别加入1 mL 0.1 mg/mL的NOR标准溶液，于恒温培养振荡器中吸附120 min，磁铁吸附后取上清液，检测其NOR的残留量，计算其吸附效率。考察MMIPs NPs用量对吸附效率的影响。

2 结果与分析

2.1 Fe3O4@NH2NPs的制备

2.1.1 Fe3O4@NH2NPs的制备及稳定性

制备的Fe3O4NPs和Fe3O4@NH2NPs呈黑色，在外加磁场作用下可快速聚集，具有良好的磁性。120℃热风干燥时，Fe3O4NPs的颜色由黑色变为红褐色，说明其完全被氧化；而Fe3O4@NH2NPs仍为黑色，未发生氧化。故氨基修饰能有效保护Fe3O4NPs不被氧化。

2.1.2 Fe3O4NPs活化时间的确定

制备的Fe3O4NPs表面只有极少量的-OH，经TMAOH活化后可在其表面形成更多的-OH，而-OH的含量影响后续的氨基修饰过程[16]。根据文献[17]的方法测定了Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量，即取20 mg Fe3O4@NH2NPs，加入10 mL 0.1 mol/L的HCl标准溶液，超声振荡均匀，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，记录滴定终点时消耗NaOH的体积，计算Fe3O4@NH2NPs表面氨基的含量。活化时间对Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量的影响如图1所示。

图1 活化不同时间制备的Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量Fig.1 Amino content of Fe3O4@NH2NPs synthesized after different times of activation

结果表明，Fe3O4NPs活化2 h后制备的Fe3O4@NH2NPs，其表面氨基含量为0.122 5 mmol/g，已达平衡，相对于未经活化制备的Fe3O4@NH2NPs的表面氨基含量（0.068 3 mmol/g）增加了约79%，故Fe3O4NPs的活化时间为2 h。

2.2 MMIPs NPs的制备

2.2.1 检测波长的确定

图2为Fe3O4@NH2NPs、NOR、DA和NaOH的紫外光谱图。Fe3O4@NH2NPs和NaOH无明显紫外吸收。DA在285 nm处有吸收峰，而NOR在285、323、335 nm处均出现了明显的吸收峰，且323 nm处的吸收峰比335 nm更强。故NOR的检测波长选择323 nm。

图2 NOR、DA、Fe3O4@NH2NPs及NaOH的紫外光谱Fig.2 UV spectra of NOR，DA，Fe3O4@NH2NPs and NaOH

2.2.2 MMIPs NPs对NOR吸附效率的计算

配置0.004 mg/mL～0.1 mg/mL的NOR标准溶液，在323nm处检测其吸光度值，建立NOR标准曲线，见图3。

图3 不同浓度NOR的紫外光谱Fig.3 UV spectra of different concentrations of NOR

取MMIPsNPs富集分离NOR后的上清液，在323nm处测其吸光度值，根据标准曲线计算上清液残留的NOR浓度，即可计算MMIPs NPs对NOR的吸附效率，公式如下：

式中：C0为吸附前NOR的初始浓度，mg/mL；C为吸附后上清液中残留的NOR浓度，mg/mL。

2.2.3 NOR洗脱液的确定

4种洗脱方式洗脱的20 mg MMIPs NPs，吸附1 mL 0.1 mg/mL NOR标准溶液2 h的吸附效率见图4。

图44 种洗脱方式下的MMIPs NPs对NOR的吸附效率Fig.4 Adsorption efficiency of MMIPs NPs to NOR after 4 different elution methods

由图4可知，采用体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液作为洗脱液，其吸附效率最高，为88.79%，用体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液与1 mmol/L NaOH交替洗脱，其吸附效率为85.37%，1 mol/L NaOH的洗脱效果最差，为39.38%。故优选体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液作为模板分子的洗脱液。

2.2.4 模板分子与功能单体物质的量比的确定

模板分子与功能单体不同物质的量比制备的MMIPs NPs，对NOR的吸附效率见图5。

图5 不同模板分子与功能单体物质的量比制备的MMIPs NPs对NOR的吸附效率Fig.5 Adsorption efficiency of MMIPs NPs synthesized by different amount of substance ratios of NOR and DA on NOR

由图5可知，随着DA的量逐渐增大，吸附效率逐渐增加，这可能是由于DA的增加，形成的分子印迹孔穴的数量增加。当NOR和DA的物质的量比为1∶15时，吸附效率最大，为99.17%，相对标准偏差为1.03%。当NOR和DA的物质的量比为1∶20时，吸附效率减小至96.91%，这可能是因为DA的用量过多导致分子印迹层变厚，掩盖了部分分子印迹孔穴[18-19]。故模板分子与功能单体的最佳物质的量比为1∶15。

2.2.5 Fe3O4@NH2NPs添加量的确定

不同Fe3O4@NH2NPs添加量制备的MMIPs NPs，对NOR的吸附效率见图6。

图6 不同Fe3O4@NH2NPs添加量制备的MMIPs NPs对NOR的吸附效率Fig.6 Adsorption efficiency of MMIPs NPs synthesized on NOR based on different addition amount of Fe3O4@NH2NPs

由图6可知，分别取4、10、15 mg的MMIPs NPs进行吸附时，Fe3O4@NH2的添加量为500 mg制备的MMIPs NPs的吸附效率分别为55.24%、94.23%、99.17%，而Fe3O4@NH2NPs的添加量为250 mg和750 mg制备的MMIPs NPs均没有Fe3O4@NH2的添加量为500 mg制备的MMIPs NPs的吸附效率高，可能原因是250 mg的Fe3O4@NH2NPs的添加量过少，导致形成的分子印迹层较厚，从而掩盖了部分分子印迹孔穴，最终使得吸附效率下降。而750 mg的Fe3O4@NH2NPs的添加量过多，部分Fe3O4@NH2NPs表面没有完全形成分子印迹层，使得吸附效率下降。故Fe3O4@NH2NPs的最佳添加量为500 mg。

2.2.6 MMIPs NPs的最佳制备方法

称取500 mg Fe3O4@NH2NPs加入100 mL体积比为 1∶1的乙醇-水溶液（含 10 mmol/L Tris-HCl，pH8.5）超声溶解10 min后加入15 mg NOR搅拌10 min，再加入134 mg DA（稍过量）混合。25℃水浴，300 r/min机械搅拌反应2 h。反应停止后，静置2 h。用磁铁对其进行富集分离后，用水和体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液洗涤后真空干燥，得到MMIPs NPs。磁性非分子印迹纳米粒子（MNIPs NPs）的制备除不添加模板分子外，其他条件与MMIPs NPs制备方法一致。

2.3 吸附时间对吸附效率的影响

4 mg的MMIPs NPs和MNIPs NPs分别对1 mL 0.02 mg/mL NOR吸附效率随时间的变化如图7所示。

图7 吸附时间对吸附效率的影响Fig.7 Influence of adsorption time on adsorption efficiency

由图7可知，相同条件下，随着吸附时间的增加，吸附效率不断上升，在60 min时基本达到平衡，此时的吸附效率为94.61%，是MNIPs NPs（43.39%）的2.18倍，说明制备的MMIPs NPs具有能结合NOR的分子印迹孔穴。

2.4 MMIPs NPs用量对吸附效率的影响

不同MMIPs NPs用量对0.1 mg NOR的吸附效率如图8所示。

图8 MMIPs NPs用量对吸附效率的影响Fig.8 Effect of MMIPs NPs dosage on adsorption efficiency

由图8可知，在吸附相同时间的情况下，吸附效率随着MMIPs NPs用量的增加而上升，在用量为15 mg时基本达到平衡，此时吸附效率为99.17%，相对标准偏差为1.03%，基本已完全吸附。说明吸附相同质量的NOR，MMIPs NPs的用量越大，吸附效率越高。

3 结论

MMIPs NPs因其能够特异性识别和吸附样品中的目标物，并在外加磁场作用下可快速与基质分离，在分析检测领域得到了广泛地应用[12，20-21]。本研究首先采用化学共沉淀法制备了Fe3O4NPs，并发现用7%TMAOH对其活化2 h，再进行氨基修饰能够使Fe3O4NPs表面氨基含量大大增加。然后以Fe3O4@NH2NPs为磁性载体、NOR为模板分子、DA为功能单体和交联剂，成功制备了NOR的MMIPs NPs。所制备的4 mg MMIPs NPs吸附 1 mL 0.02 mg/mL的 NOR 60 min，其吸附效率可达94.61%，是相同条件下MNIPs NPs的2.18倍。15 mg MMIPs NPs吸附1 mL 0.1 mg/mL的NOR 60 min，其吸附效率可达99.17%，相对标准偏差为1.03%，说明可通过调整MMIPs NPs用量实现对NOR的完全吸附。该制备方法简单、成本低廉，可快速有效富集分离NOR，且能重复利用，对简化样品前处理步骤、提升前处理效率、提高分析结果的准确性和重现性具有重要的实际意义。