阿法替尼和塞瑞替尼微生物限度检查方法验证

张光华，李玉立，刘文杰，牛振东，江志杰

（北京市药品检验所中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206）

阿法替尼是新一代口服小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI），可关闭癌细胞信号通路、抑制肿瘤生长，主要用于非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗。塞瑞替尼是间变性淋巴瘤激酶（ALK）抑制剂，用于一线治疗ALK+转移性NSCLC。2015 年版《中国药典（四部）》通则1107［1］非无菌药品微生物限度标准规定，口服片剂、胶囊剂需氧菌总数不得超过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数不得超过102cfu/g，1 g 中不得检出大肠埃希菌。本研究中按照2015 年版《中国药典（四部）》通则1105 和通则1106［1］的要求，综合考虑消除抑菌性及简便易操作等因素，建立了适合阿法替尼片、塞瑞替尼胶囊的微生物限度检查方法，并对3 批产品进行方法适用性试验。现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LRH-250 型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；XG1.DMXD-0.36 型电热脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；1300SERIESA2 型生物安全柜（Thermo Fisher Scientific 公司）；ML1602 型电子天平（梅特勒公司，精度为0.01 g）；SHKE 6000-1CE型恒温摇床（Thermo Scientific 公司）。

1.2 药品

阿法替尼片（S1，Boehringer Ingelheim Pharma GmbH& Co.KG 公 司，批 号 分 别 为 202525U，306342，305921B，编号分别为1，2，3，规格为每片50 mg）；塞瑞替尼胶囊（S2，Novartis Pharma Stein AG 公司，批号分别为S0009D，S0011，S0010A，编号分别为1，2，3，规格为每粒150 mg）。

1.3 试验菌种

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］，铜 绿 假 单 胞 菌 Pseudomonas aeruginosa［CMCC（B）10104］，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B）26003］，大 肠 埃 希 菌 Escherichia coli［CMCC（B）44102］，白 色 念 珠 菌 Candida albicans［CMCC（F）98001］，黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98003］，均购自中国食品药品检定研究院，菌株传代数为第3 代。

1.4 培养基和试剂

胰酪大豆胨液体培养基（TSB），胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），沙氏葡萄糖液体培养基（SDB），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA），均购自美国BD 公司；pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，麦康凯液体培养基，麦康凯琼脂培养基，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；吐温80（国药集团化学试剂有限公司）；卵磷脂（Sigma 公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 菌液制备按2015 年版《中国药典（四部）》通则1105［1］微生物计数法制备菌液。

2.1.2 供试液制备

取供试品S1 和S2 各10 g，分别置100 mL 锥形瓶中，加pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至刻度，充分振摇，制成1 ∶10 的供试液S1A 和S2A。取1 ∶10 的供试液1 mL，置pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL中，即得1 ∶100 的供试液S1A 和S2A。

取供试品S1 和S2 各10 g，分别置100 mL 锥形瓶中，加入含有3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至刻度，充分振摇，制成1 ∶10 的供试液S1B 和S2B。取1 ∶10 的供试液1 mL，置含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL 中，即得1 ∶100 的供试液S1B 和S2B。

2.2 培养基适用性检查

培养基均在验证合格的灭菌程序下灭菌，按2015年版《中国药典（四部）》通则1105［1］微生物计数法中培养基的适用性检查方法进行，结果均符合要求。

2.3 微生物计数方法抑菌性筛查试验

2.3.1 常规稀释剂1 ∶10 供试液和1 ∶100 供试液

菌液对照组：取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9 mL，加入制备好的试验菌液0.1 mL（细菌、酵母菌500～1 000 cfu，霉菌300～600 cfu），混匀，使每1 mL稀释液中含菌量为30～100 cfu。分别取上述菌悬液1 mL注入平皿中，测定每1 mL 的活菌数。

供试品对照组：取1∶10 供试液S1A 和S2A 各9.9mL，分别加入稀释剂0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。取1 ∶100供试液S1A 和S2A 各9.9 mL，分别加入稀释剂0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定其需氧菌总数。

试验组：取1 ∶10 的供试液S1A 和S2A 9.9 mL 各5 份，分别加入制备好的试验菌液0.1 mL，混匀，取1 mL注入平皿中，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。取1 ∶100 供试液S1A 和S2A 9.9 mL 各5 份，分别加入制备好的试验菌液0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定需氧菌总数。

检测方法：需氧菌总数测定用TSA，置33 ℃培养5 d，逐日观察结果；霉菌和酵母菌总数测定用SDA，置23 ℃培养7 d，逐日观察结果。

结果分析：结果见表1。可见，S1A 的微生物计数采用1 ∶10 和1 ∶100 供试液用平皿法检查，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收比值均为0，表明S1A 的1 ∶10和1 ∶100 供试液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌性，该方法不适合S1 的需氧菌总数计数。S1A 的1 ∶10 供试液白色念珠菌（SDA）和黑曲霉（SDA）的回收比值在0.5～2.0 范围内，该方法适合S1 的霉菌和酵母菌总数计数。S2A 的微生物计数采用1 ∶10 和1 ∶100 供试液用平皿法检查，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收比值均为0，白色念珠菌的回收比值为0 和0.14，表明S2A 的1 ∶10 和1 ∶100 供试液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有抑菌性，该方法不适合S2 的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

表1 S1A 和S2A 微生物计数抑菌性筛查试验结果

2.3.2 稀释剂添加3%吐温80 和0.3%卵磷脂用于验证2.3.1 项下回收比值小于0.5 的供试液。菌液对照组：同2.3.1 项下菌液对照组。

供试品对照组：取1 ∶10 供试液S2B 9.9 mL，加入稀释剂0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定供试品的霉菌和酵母菌总数；取1 ∶100 供试液S1B 和S2B 9.9 mL，分别加入稀释剂0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定供试品的需氧菌总数。

试验组：取1 ∶10 供试液S2B 9.9 mL，加入制备好的白色念珠菌试验菌液0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定霉菌和酵母菌总数；取1 ∶100 供试液S1B和S2B 9.9 mL 各5 份，分别加入制备好的试验菌液0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定需氧菌总数。

检测方法：需氧菌总数测定用TSA，置33 ℃培养5 d，逐日观察结果；霉菌和酵母菌总数测定用SDA，置23 ℃培养7 d，逐日观察结果。

结果分析：结果见表2。可见，S1B 的需氧菌总数计数采用1 ∶100 供试液用平皿法检查，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收比值均在0.5～2.0 范围内，表明S1B 的1 ∶100 供试液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性已消除，该方法适合S1 的需氧菌总数计数。S2B 的需氧菌总数计数采用1 ∶100 供试液用平皿法检查，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收比值均小于0.5，表明S2B 的1 ∶100 供试液对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌性，该方法不适合S2 的需氧菌总数计数。S2B 的霉菌和酵母菌数总数计数采用1 ∶10 供试液用平皿法检查，白色念珠菌的回收比值小于0.5，表明S2B 的1 ∶10 供试液对白色念珠菌有抑菌性，该方法不适合S2 的霉菌和酵母菌总数计数。

2.3.3 稀释剂和培养基均添加3%吐温80 和0.3%卵磷脂

用于验证2.3.2 项下回收比值小于0.5 的供试液。

菌液对照组：同2.3.1 项下菌液对照组。

供试品对照组：取1 ∶10 供试液S2B 9.9 mL，加入稀释剂0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定供试品的霉菌和酵母菌总数。取1 ∶100 供试液S2B 9.9 mL，加入稀释剂0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定供试品的需氧菌总数。

试验组：取1 ∶10 供试液S2B 9.9 mL，加入制备好的白色念珠菌试验菌液0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定霉菌和酵母菌总数。取1 ∶100 供试液S2B 9.9 mL 各5 份，分别加入制备好的试验菌液0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿中，测定需氧菌总数。

检测方法：需氧菌总数测定用含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的TSA，置33 ℃培养5 d，逐日观察结果；霉菌和酵母菌总数测定用含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的SDA，置23 ℃培养7 d，逐日观察结果。

测定结果：结果见表3。可见，S2B 的需氧菌总数计数采用1 ∶100 供试液用平皿法检查，培养基用含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的TSA，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收比值均在0.5～2.0 范围内，表明S2B的1 ∶100 供试液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性已消除，该方法适合S2 的需氧菌总数计数。S2B的霉菌和酵母菌数总数计数采用1 ∶10 供试液用平皿法检查，培养基用含3% 吐温80 和0.3% 卵磷脂的SDA，白色念珠菌的回收比值在0.5～2.0 范围内，表明S2B 的1 ∶10 供试液对白色念珠菌的抑菌性已消除，该方法适合S2 的霉菌和酵母菌总数计数。

2.4 微生物计数方法适用性试验

菌液组：取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9 mL，加入制备好的试验菌液0.1 mL（细菌、酵母菌500～1 000 cfu，霉菌300～600 cfu），混匀，使每1 mL 稀释液中含菌30～100 cfu。分别取1 mL 注入平皿，测定每1 mL 的活菌数。

供试品对照组：取S1B 和S2B 的1 ∶100 供试液9.9 mL，分别加入稀释剂0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿，测定供试品的需氧菌总数；取S1B 和S2B 的1 ∶10供试液9.9 mL，加入稀释剂0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿，测定其霉菌和酵母菌总数。

试验组：分别取S1B 和S2B 的1 ∶100 供试液9.9 mL各5 份，加制备好的试验菌液0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿，测定需氧菌总数。分别取S1B 和S2B 的1 ∶10供试液9.9 mL 各2 份，加制备好的真菌菌液0.1 mL，混匀，取1 mL 注入平皿，测定霉菌和酵母菌数。

稀释剂对照组：分别取含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9 mL 5 份，加入制备好的试验菌液0.1 mL（300～1 000 cfu），混匀，取1 mL 注入平皿，测定每1 mL 的活菌数。

添加中和剂的培养基对照组：分别取菌液组制备好的菌液1mL 注入平皿，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。

检测方法：上述已注入供试液的平皿，S1 需氧菌总数测定倾注TSA，霉菌和酵母菌总数测定倾注SDA。S2及添加中和剂的培养基对照组，需氧菌总数测定倾注含3%吐温80 和0.3%卵磷脂的TSA，霉菌和酵母菌总数测定倾注含3%吐温80 和0.3%卵磷脂的SDA。需氧菌总数测定置33 ℃培养5 d，逐日观察结果；霉菌和酵母菌总数测定置23 ℃培养7 d，逐日观察结果。

结果分析：结果见表4。可见，稀释剂对照组回收比值均在0.5～2.0 范围内，表明含3%吐温80 和0.3%卵磷脂的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对微生物无毒性［3-4］。S1 和S2 枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值均在0.5～2.0 范围内，提示3%吐温80 和0.3% 卵磷脂在本研究中的有效性［3-4］，该方法进行S1 和S2 的需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数方法准确、可行。

表4 S1 和S2 微生物计数方法适用性试验结果（n=3）

2.5 控制菌检查方法适用性试验

供试品对照组：取S1B 和S2B 的1 ∶10 供试液10 mL，分别加入TSB 100 mL 中，33 ℃培养24 h。

阴性对照组：取稀释液10 mL，置TSB 100 mL 中，33 ℃培养24 h。

阳性对照组：取S1B 和S2B 的1 ∶10 供试液10 mL，分别加入TSB 100 mL 中，再加入不大于100 cfu 的大肠埃希菌，33 ℃培养24 h。

检测方法：分别取上述预培养物1 mL，加入麦康凯液体培养基100 mL 中，42 ℃培养24 h 后，再分别划线于麦康凯琼脂平板上，33 ℃培养24 h，观察结果。

结果分析：结果见表5。可见，S1 和S2 阳性对照菌生长良好，表明S1 和S2 在该条件下对大肠埃希菌无抑菌作用或其抑菌作用可忽略不计。表明采用该方法进行S1 和S2 的大肠埃希菌检查方法可行。

表5 控制菌检查方法适用性试验结果

3 讨论

3.1 中和剂吐温80 和卵磷脂的应用

吐温80 和卵磷脂是《中国药典》《欧洲药典》收载的常用中和剂，可添加至稀释剂或培养基中［1-2］。试验证明，3%吐温80 和0.3% 卵磷脂对微生物无毒性。吐温80为非离子表面活性剂，卵磷脂为两性离子表面活性剂，均可降低季铵类化合物、酚、醛、对羟基苯甲酸类、二重双肌类、碘酒、洗必泰类、石炭酸类药物的活性［3］。卵磷脂是细胞膜上最主要的脂质，其脂肪酸种类会影响细胞的流动性及通透性；通过影响细胞膜上许多酵素的功能来调控细胞生长；可改变细胞膜功能，是细胞膜修复的营养剂。3%吐温80 和0.3% 卵磷脂对部分有抑菌作用化学药可作为中和剂，可降低抑菌作用［3-6］。

3.2 微生物限度检查方法的确立

阿法替尼片：取供试品10 g，加含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，充分振摇，制成1 ∶10 的供试液，取1 ∶10 供试液1 mL，置含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL 中，即为1 ∶100 的供试液。需氧菌总数计数取1 ∶100 供试液1 mL 注入平皿，按2015 年版《中国药典》通则1105 方法检查；霉菌和酵母菌总数计数，取1 ∶10 供试液1 mL 注入平皿，按2015 年版《中国药典》通则1105 方法检查。大肠埃希菌检查，取1 ∶10 供试液10 mL，置TSA 100 mL 中，按2015 年版《中国药典》通则1106 方法检查。

塞瑞替尼胶囊：取供试品10 g，加入含3%吐温80和0.3% 卵磷脂的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，充分振摇，制成1 ∶10 的供试液，取1 ∶10 供试液1 mL，置含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL 中，即得1 ∶100 的供试液。需氧菌总数计数取1 ∶100 供试液1 mL 注入平皿，培养基为含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的TSA，按2015 年版《中国药典》通则1105 方法检查；霉菌和酵母菌总数计数，取1 ∶10 供试液1 mL 注皿，培养基为含3%吐温80 和0.3% 卵磷脂的SDA，按2015 年版《中国药典》通则1105 方法检查；大肠埃希菌检查，取1 ∶10供试液10 mL，置TSB 100 mL 中，按2015 年版《中国药典》通则1106 方法检查。

3.3 替尼类抗癌药物的微生物检查方法建立的思路

替尼类抗癌药物对微生物都有一定的抑菌作用，尤其是对细菌。抑菌性筛查试验结果也表明，S1 和S2 对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均有很强的抑菌作用。建议可直接采用含3%吐温80 和0.3%卵磷脂的稀释液，如1 ∶10 供试液的回收率低于《中国药典》要求，直接采用1 ∶100 供试液进行试验，抑菌性更强的可选择在培养基中添加3%吐温80 和0.3% 卵磷脂。本研究中的2 种替尼类抗癌药物，通过稀释法和中和法，均消除了其抑菌作用，符合《中国药典》的相关规定，可用于产品的质量控制，并为口服替尼类抗癌药物的微生物限度的检查提供了参考。