华蟾素对卵巢癌细胞增殖侵袭能力的抑制作用*

陈永宏，高 月，陈禄娅

（重庆市北碚区中医院，重庆 400700）

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤，由于其侵袭能力强，转移快，死亡率高，且在我国发现时间相对较晚，多处于中晚期，手术治疗效果较差，有些患者甚至已失去了手术治疗的机会［1-2］。华蟾素的主要有效成分包括甾类强心苷和生物碱［3］。研究证明，其对肝癌细胞和喉癌细胞的DNA 合成、RNA 合成有较强的抑制作用［4-5］，且对上述2 种肿瘤细胞的分化和凋亡具有调控作用［6］。但目前，尚未见其对卵巢癌细胞增殖凋亡及侵袭作用的影响研究。本研究中探讨了华蟾素对卵巢癌细胞SKOV-3细胞系增殖凋亡和侵袭作用的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：JK-JH01 型超净工作台（安徽杰克欧德实验室设备有限公司）；RYX-50 型实验室培养箱（北京鑫润科诺仪器仪表有限公司）；PH100 型倒置显微镜（凤凰光学股份有限公司）；TMS-2040 型流式细胞分析仪（苏州陶迈森科学仪器有限公司）；BG-XM496 型酶标仪（厦门西谷生物工程有限公司）；DYCZ-40G 型蛋白电泳系统（北京六一仪器厂）。

试药：华蟾素（安徽金蟾生化股份有限公司，国药准字Z34020273，规格为每支5 mL）；四氮唑（MTT）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号为C0009）；小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；RPMI1640 培养基（北京亚米生物科技有限公司，批号为C11875500BT）；凋亡细胞检验试剂盒（广州威佳科技有限公司，批号为JXA005）；Bcl-2 蛋白检验试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，批号为F15155），Bax 蛋白检验试剂盒（北京白奥莱博科技有限公司，批号为KFS216-VGC）；E-cadherin（批号为14472S）和基质金属蛋白酶-7（MMP-7，批号为3801S），均购自北京生物通生物科技有限公司。

细胞：SKOV-3 细胞系（美国Sciencell 研究室）。

1.2 方法

细胞培养：将对数生长期的SKOV-3 细胞分为对照组（A 组），低、中、高剂量组（B1组，B2组，B3组）。A 组细胞用仅含有10%小牛血清去蛋白的1640 培养基培养；B1组，B2组，B3组分别用含有0.1，1.0，10.0 mg/L 华蟾素的上述培养基培养。于37 ℃及5%CO2培养箱中培养。

MTT 法检测：将各组细胞以1×103/L 的浓度在96 孔板中分别培养24，48，72 h，按试剂盒使用说明用100 μL MTT 溶液进行染色，染色3 min，于显微镜下使用血细胞计数板进行计数。

细胞存活率（%）=（总细胞数-蓝色细胞数）/细胞总数×100%

细胞增殖抑制率（%）=（对照组相应细胞存活率-实验组相应细胞存活率）/对照组相应细胞存活率×100%

流式细胞分析：调整各组细胞浓度为1×105/L，接种在12 孔板后，相应条件下培养24，48，72 h。然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤重悬，调整细胞浓度为2×106/L，加入Annexin V-FITC 抗体和碘化丙啶在室温避光条件下孵育30 min。使用流式细胞分析仪进行检测，采用WinMDI 2.9 和FCS Express V3 软件进行分析。

蛋白质印迹（WB）法检测蛋白表达量：将各组细胞分别培养相应时间后，提取细胞蛋白组分，检测蛋白含量，将各组细胞提取的蛋白质进行SDS-PAGE 电泳分离，每孔加入蛋白40 μg。电泳结束后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，按试剂说明先后用相应一抗、二抗进行孵育显色，最后显影。

蛋白相对表达量=蛋白表达量实验组/蛋白表达量对照组×100%

细胞侵袭力检测：将各组细胞在相应培养条件下培养24，48，72 h 后，将细胞洗涤后用DMEM 培养基调整细胞浓度为3×105/mL，根据分组加入华蟾素调整药物质量浓度分别为0，0.1，1.0，10.0 mg/L。细胞悬液准备完毕后，准备Transwell，配置完毕，每个小室内加入各组相应的细胞悬液100 μL，再将小室放置在盛有75 mL含15%胎牛血清的DMEM 培养基的24 孔板内，37 ℃及5%CO2培养箱培养24 h，4%甲醛固定小室内细胞20 min，染色计数，每个膜分别取5 个视野计数，取平均数。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对SKOV-3 细胞增殖作用的影响

各组细胞在相应条件下分别培养24，48，72 h 后，在相同培养时间内，4 组细胞间增殖抑制率存在显著差异，A 组细胞增殖抑制率显著低于B1组，B2组，B3组，随着药物质量浓度的升高，B1组，B2组，B3组的增殖抑制率也显著升高，且组间存在显著差异（P＜0.05）；使用相同药物质量浓度干预的条件下，随着培养时间的延长，细胞增殖抑制率显著升高。详见图1 A。

图1 各组细胞不同处理时间下增殖抑制率、凋亡率和穿膜细胞数比较

2.2 对SKOV-3 细胞凋亡作用的影响

SKOV-3 细胞经不同质量浓度的华蟾素干预后，4 组细胞凋亡率存在显著差异。其中，B1组凋亡率显著高于A 组，B2组高于B1组，B3组高于B2组；随着培养时间的延长，组内细胞凋亡率也显著升高。详见图1 B。

2.3 对SKOV-3 细胞侵袭性的影响

相同培养时间内，随着华蟾素质量浓度的升高，穿膜细胞数显著减低，A 组显著多于B1组，B1组显著多于B2组，B2组显著多于B3组；在相同药物质量浓度条件下，随着培养时间的延长，B1组，B2组，B3组穿膜细胞数显著减少，而A 组穿膜细胞数随着培养的时间延长未见明显变化。详见图1 C。

2.4 对SKOV-3 细胞凋亡及侵袭相关蛋白表达的影响

在相同培养时间下，随着华蟾素质量浓度的升高，SKOV-3 细胞Bax 蛋白和E-cadherin 蛋白表达量显著升高，A 组显著低于B1组，B1组显著低于B2组，B2组显著低于B3组；而Bcl-2 蛋白和MMP-7 蛋白表达量显著降低，A 组显著高于B1组，B1组显著高于B2组，B2组显著高于B3组。随着培养时间的延长，A 组细胞4 种蛋白表达量均未出现明显变化，B1组，B2组，B3组细胞Bax 蛋白和E-cadherin 蛋白表达量显著升高，Bcl-2蛋白和MMP-7 蛋白表达量显著降低。详见图2。

图2 各组细胞不同处理时间下各蛋白表达情况

3 讨论

华蟾素是从蟾蜍皮肤及腮腺提取的脂溶性成分，主要成分包括生物碱和强心甾，其中吲哚生物碱为抗肿瘤主要成分［7］，可用于肝癌、鼻咽癌及食管癌的治疗［8-10］。华蟾素对肿瘤细胞具有调整细胞周期进程、阻碍细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用［11-13］。

本研究结果发现，华蟾素有抑制肿瘤细胞增殖的作用，且随着其质量浓度的升高和培养时间的延长，其增殖抑制作用更显著。可见，华蟾素对卵巢癌细胞增殖有抑制作用，且存在质量浓度和时间依赖性。华蟾素处理细胞后，细胞凋亡率显著升高，且随着药物质量浓度的升高、作用时间的延长而显著增高，提示华蟾素促进卵巢癌细胞凋亡的作用呈质量浓度和时间依赖性。

本研究结果显示，华蟾素有抑制肿瘤细胞Bcl-2蛋白表达和促进Bax 蛋白表达的作用，且存在时间和质量浓度依赖性，这与文献［14-15］的报道一致。提示华蟾素抑制卵巢癌细胞增殖、促进其凋亡的作用与调控Bcl-2 家族蛋白相关。

本研究结果显示，华蟾素可有效抑制肿瘤细胞侵袭性，且呈质量浓度和时间依赖性。E-cadherin 蛋白是介导细胞间黏附的一种蛋白受体，其表达下降是很多肿瘤细胞侵袭性升高的重要分子机制［16］。MMP-7 蛋白对于细胞外基质的重要成分如Ⅳ型胶原蛋白、弹力素、层粘连蛋白等均有较强的分解作用，MMP-7 高表达对于多种肿瘤细胞突破血管壁或淋巴管壁进行远处播散有重要作用［17-18］。提示华蟾素可有效抑制MMP-7 表达升高、E-cadherin 蛋白表达，从而降低卵巢癌细胞的侵袭性，且呈质量浓度和时间依赖性。

综上所述，华蟾素对卵巢癌SKOV-3 细胞系有抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，与其下调Bcl-2 蛋白表达、上调Bax 蛋白表达相关；同时，还具有抑制SKOV-3细胞系侵袭性的作用，与其下调细胞MMP-7 蛋白表达、上调E-cadherin 蛋白表达相关。且均呈质量浓度和时间依赖性。