预处理及培养方法协同作用对新铁炮百合种子萌发的影响

吴小媚，袁延平，魏肖如，曹福祥，陈己任，吕长平，李玉帆

(湖南农业大学园艺园林学院/湖南省中亚热带优质花木繁育与利用工程技术研究中心，长沙 410128)

0 引 言

【研究意义】百合是百合科百合属(Lilium)所有植物的泛称，为单子叶球根花卉。百合的繁殖方法主要有分球繁殖、鳞片扦插繁殖、珠芽繁殖、种子繁殖和组织培养等[1]。对于大多数种类的百合而言，种子繁殖存在着萌发率低、后代变异性大，同期时间较长等问题，经过2～3年的栽培时间才能开花，目前市场上百合的繁殖方法多采用分球繁殖和鳞片扦插等无性繁殖方法[2]。 新铁炮百合(Lilium×formolongi)是百合属中罕见的播种繁殖1年开花的杂交品种，由日本Nishimura于1928年通过麝香百合和台湾百合的反复杂交培育而来[3]。其花朵具有向上开放的独特花姿，花色洁白且香气浓郁，耐热性强，是良好的鲜切花材料。尤其是新铁炮百合播种繁殖1年开花的特性能够解决百合种球繁殖中病毒感染和种球退化的问题，在我国华南地区得到了广泛的引种栽培，具有广阔经济效益前景[4]。研究新铁炮百合种子萌发的预处理方式和培养方法，获得最短时间打破休眠、萌发整齐一致的实生苗，对新铁炮百合花卉生产具有重要意义。【前人研究进展】王新颖[5]研究表明，通过PEG的引发处理能够提高新铁炮百合种子的发芽能力；郝渊鹏等[6]研究表明,经过低温浸泡5 d并剥皮处理的种子在无菌播种条件下发芽率较为理想；韩秀丽等[7]研究表明,24℃以上的高温将会阻碍新铁炮百合种子的萌发；可溶性糖作为种子贮藏和萌发过程中的主要物质基础及呼吸底物[10]，其在种子萌发过程中的变化能充分体现种子的发芽状况。超氧化物歧化酶(SOD)可以消除生物体在新陈代谢中产生的有害物质，能催化过氧阴离子发生歧化反应从而清除超氧阴离子自由基而抵御膜脂过氧化，减少膜伤害[12]。【本研究切入点】尚不明确不同的预处理及培养方法协同作用对种子萌发有着什么样的影响，目前关于新铁炮百合种子萌发的研究报道较少，针对新铁炮百合种子萌发过程中的生理指标的变化亦尚无研究报道。 研究预处理及培养方法协同作用对新铁炮百合种子萌发的影响。【拟解决的关键问题】以新铁炮百合雷山1号种子为材料，采用三因素四水平正交试验设计，研究不同预处理方式、培养温度以及培养方式对种子发芽的影响，为新铁炮百合实生苗的规模化繁殖生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

新铁炮百合雷山1号种子。

1.2 方 法

1.2.1 预处理及培养方法协同作用正交试验

采用L16(45)正交试验设计，设种子预处理方式(A)、培养温度(B)和培养方式(C)三个因素，每个因素设4个水平。正交试验共16个处理，每个处理50粒种子，重复3次，共用种子2 400粒。表1

表1 试验因子及水平Table 1 The factors and levels

因素A种子预处理方式设置4个水平， 水平A1为4℃浸种7 d，将种子装在烧杯里加无菌水浸没后置于4℃冰箱7 d；水平A2为GA3(100 mg/kg)处理2 h，GA3经NaOH溶解后用蒸馏水配制成100 mg/kg的溶液；水平A3为4℃浸种7 d后再用GA3(100 mg/kg)处理2 h；水平A4为对照CK，不做任何处理。

因素B为种子培养温度，设置了4个水平，分别为15、18、21和25℃ ，用B1、B2、B3和B4表示。将经过不同预处理的种子分别放置于各温度水平的恒温恒湿光照培养箱中，湿度50%，光照时间16 h，黑暗8 h。

因素C为种子培养方式。水平C1采用MS培养基无菌培养，培养基配方为MS+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂，pH 5.8。水平C2为MS+0.01 mg/L NAA培养基无菌培养，培养基配方为MS+0.01 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂，pH 5.8。无菌培养操作过程首先将预处理过的种子置于自来水下冲洗2 h，再置于超净工作台中用70%酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，有效氯2%的次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干水分后接种于培养基中。水平C3为培养皿培养，培养皿洗净后铺上无菌水打湿的滤纸，播种后每天观察种子萌发情况，滤纸干燥时及时补充水分。水平C4是土壤培养，以进口草炭土为播种基质，将种子均匀点播于经过高温杀菌的土壤表面后覆上一层细土。

1.2.2 培养温度对新铁炮百合种子萌发的生理特性影响

种子进行4℃ 7 d浸种后，采用培养皿培养的方式，分别置于15、18、21和25℃ 4个处理梯度的恒温恒湿光照培养箱中，湿度50%，光照/黑暗：16 h/8 h，每个处理30粒种子，重复3次。每天观察种子的萌发情况，检查并保持滤纸湿润，每隔3 d取样测定可溶性糖含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[8]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法测定[9]。

1.3 数据处理

通过肉眼观察，记录每天的种子萌发数量，以胚根突破种皮1 mm为萌发标志，连续5 d没有新的种子萌发记为发芽结束。

种子发芽率(Si)=发芽种子数/共检测的种子数×100%.

种子发芽指数(Gi)=ΣGt/Dt.

其中Gt为在时间t的发芽数，Dt为发芽日数。试验种子发芽指数在播种后第9 d测定。

使用Excel表格结合DPS软件对试验数据进行整理统计分析，采用Duncan新复极差法进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 预处理及培养方法协同作用正交试验

2.1.1 预处理及培养方法正交试验最高萌发率处理组合的确定

研究表明,新铁炮百合雷山1号种子在不同的处理下种子发芽率、发芽指数存在明显差异。其中处理11的发芽率最高，发芽率98.67%，显著高于处理8、12、14(P<0.05)，但与其它处理差异不显著。种子发芽率最低的是处理12，发芽率仅46.67%。发芽指数是衡量种子发芽能力及整齐程度的重要指标。从发芽指数的多重比较结果看，发芽指数最高的为处理11，9 d发芽指数达到4，与处理2、4、9相比差异不显著，但是显著高于其它处理(P<0.05)，发芽指数最低的为处理13，仅为0.07。 在正交试验中，种子发芽率和发芽指数最高的处理均为11号处理，即种子经4℃浸种7 d后GA3(100 mg/kg)处理2 h，于21℃的MS培养基中培养。表1，图1

2.1.2 影响种子萌发最重要的因素及最优组合的确定

研究表明,培养温度(B)的种子发芽率极差在各因素中最大，为29.003，培养温度对新铁炮百合种子萌发影响最大，其次是种子预处理方式(A)，培养方式(C)极差最小。表2

表2 种子预处理及培养方法协同处理新铁炮百合种子发芽率正交设计Table 2 The orthogonal design table of synergistic effect of pretreatment and cultural method on Lilium ×fomolongi germination

不同的种子预处理方法、培养温度和培养方式对种子发芽率的影响存在极显著差异(P<0.01)。3个因素对种子萌发的影响程度依次为培养温度(B)>种子预处理方式(A)>培养方式(C)，与极差分析结果相同。表3

表3 各试验因子间方差Table 3 Table of variance analysis among test factors

注：(a) 4℃ 7 d浸种后GA3处理2 h于21℃ MS培养基上培养；(b)4℃ 7 d浸种后于21℃ MS+NAA培养基上培养；(c)4℃ 7 d浸种后于21℃培养皿上培养；(d)4℃ 7 d浸种后于21℃土壤上培养Note:(a)Cultivate in MS medium at 21℃ after soaking seed in 4℃ for 7 days and then treat with GA3for 2hours ;(b)Cultivate in MS+NAA medium at 21℃ after soaking seed in 4℃ for 7 days;(C)Cultivate in culture dish at 21℃ after soaking seed in 4℃ for 7 days;(d)Cultivate in soil at 21℃ after soaking seed in 4℃ for 7 days图 1 4种不同处理下的种子9 d萌发Fig. 1 Sees germination under four different treatments in 14 days

2.1.3 不同种子预处理对新铁炮百合种子萌发的影响

研究表明,其中，4℃浸种7 d的预处理方式下的种子平均发芽率和平均发芽指数要明显高于其它预处理，平均发芽率达94.5%，与其它预处理方式相比差异显著(P<0.05)。无论是平均发芽率还是平均发芽指数，CK的值都是最低的，平均发芽率76.16%，平均发芽指数仅0.48，不经预处理的种子活力最低。其中，低温浸润后经GA3处理的种子发芽率显著低于低温浸润，GA3处理并不能促进新铁炮百合种子萌发。图2

注：采用Duncan多重比较的方法进行差异显著性分析，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Note: Duncan multiple comparison method was used to analyze the significance of differences. Different lowercase letters in the same column indicated significant differences with P< 0.05图2 不同的种子预处理方式下新铁炮百合种子平均发芽率及平均发芽指数变化Fig. 2 Effects of different seed pretreatment on seed germination rate and germination index of Lilium × formolongi

2.1.4 不同培养温度对新铁炮百合种子萌发的影响

研究表明,培养温度的差异，对种子的萌发率影响甚大。21℃培养条件下的种子平均发芽率显著高于18和25℃处理(P<0.05)，达到了94.17%，比18℃处理要高13个百分点，比25℃处理高26.34个百分点。但是21℃处理和15℃处理的平均发芽率差异不显著。平均发芽率最低的培养温度是25℃，仅为65.16%。21℃处理的平均发芽指数最高，和15、18℃对比差异显著(P<0.05)，新铁炮百合雷山1号种子在21℃培养条件下的发芽能力及活力明显优于其它温度处理。 图3

注：采用Duncan多重比较的方法进行差异显著性分析，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Note: Duncan multiple comparison method was used to analyze the significance of differences. Different lowercase letters in the same column indicated significant differences with P< 0.05图3 不同培养温度下新铁炮百合种子平均萌发率及平均发芽指数变化Fig. 3 Effects of different culture temperature on seed germination rate and germination index of Lilium × formolongi

2.1.5 不同培养方式对新铁炮百合种子萌发率的影响

研究表明,土壤培养的平均发芽率和平均发芽指数都要高于其它处理。其平均发芽率为89%，显著高于MS+0.01 mg/L NAA无菌培养和培养皿培养，但是与MS无菌培养相比差异不显著(P<0.05)。平均发芽率最低的为培养皿播种，低达71.66%，和土壤播种相比，平均发芽率低了17.34个百分点。图4

注：采用Duncan多重比较的方法进行差异显著性分析，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Note: Duncan multiple comparison method was used to analyze the significance of differences. Different lowercase letters in the same column indicated significant differences with P< 0.05图4 不同培养方式下新铁炮百合种子平均萌发率及平均发芽指数变化Fig. 4 Effects of different cultivation methods on seed germination rate and germination index of Lilium × formolongi

2.1.6 种子预处理及培养方法最佳组合的发芽试验情况

研究表明,4℃浸种7 d的预处理，培养温度21℃，土壤培养条件下的新铁炮百合种子发芽率为99.18%，9 d发芽指数为4.65 ，大于正交试验中11号处理(4℃浸种7 d+GA3浸种2 h，培养温度21℃，MS培养基无菌培养)的发芽率98.67%和发芽指数4.00。图1，图4

2.2 不同培养温度对新铁炮百合种子萌发生理特性的影响

2.2.1 培养温度对新铁炮百合种子可溶性糖含量的影响

研究表明,不同温度下新铁炮百合种子内可溶性糖含量总体呈先缓慢下降后急速上升再下降的情况。在前9 d，可溶性糖含量基本呈缓慢下降趋势，种子在前期的吸涨阶段通过呼吸作用分解合成碳水化合物为生命活动提供能量。其中21℃处理的可溶性糖含量变化幅度和速度明显比其它温度处理快，分解量也大于其它处理，21℃处理种子活性和对可溶性糖的分解利用率最高。9到12 d时，可溶性糖含量升高，此时种子处于萌发阶段，淀粉等高分子多糖降解为机体可利用的可溶性糖供种子萌发所需能量。可溶性糖除了作为有机物质合成的能量来源，在非适宜生长温度等逆境条件下，还可进行溶质的积累参与渗透调节[11]。21℃处理的可溶性糖含量最低，变化幅度总体较其它处理平缓，21℃下的种子对营养物质的转化和利用率最高，种子健康程度最大。相比之，25℃的种子可溶性糖含量较高，变化异常，种子积累溶质作为渗透调节物质来抵抗不良环境，25℃不适合新铁炮种子萌发。图5

图5 不同培养温度下种子可溶性糖含量变化Fig. 5 Changes of soluble sugar content in seeds at different culture temperature

2.2.2 培养温度对新铁炮百合种子SOD活性的影响

研究表明,不同温度处理下种子内SOD活性的变化趋势整体一致，都是呈先下降后上升的波浪形走向，并在9和15 d的时候出现高峰。在前6 d的时候， 此时种子在吸涨阶段，各温度处理下种子的SOD活性变化相差不大。 在第9 d的时候，种子开始露出胚根，所有温度处理的SOD活性均迎来第1个小高峰，其中21℃的SOD活性明显高于其它处理。在15 d时，各处理的SOD活性迅速上升达到高峰，峰值最高为21℃处理，553.33 U/g，与其它处理相比差异显著。整个萌发过程中，21℃处理的种子SOD活性均明显高于其它处理，21℃下的种子抗性最强，生长状况最好。

25℃处理下的种子SOD活性在整个萌发过程中一直处于最低位置，其SOD活性变化幅度不大，25℃抑制了酶活性，种子抗逆性差。图6

图6 不同培养温度下种子SOD活性变化Fig. 6 Changes of SOD activity in seeds at different culture temperature

3 讨 论

新铁炮百合雷山1号和大多数百合种子一样，整个发芽过程持续20～30 d[13]。研究发现，不同预处理方式下，雷山1号种子的发芽率存在明显的差异，发芽效果最好的为4℃浸种7 d，表明适当低温浸润处理能提高种子的发芽率，与王新颖等[5]的报道相吻合。但与何泽明等[14]的研究结果有一定出入，其认为低温处理对新铁炮百合发芽无明显影响。何丽萍等[15]的研究表明，100 mg/L GA3处理对野生“泸定百合”种子萌发具有明显促进作用，可加快种子萌发并提高种子发芽率，解雪华[16]的试验也表明GA3浸种6 h能有效缩短大花卷丹和台湾百合的萌发时间。但试验结果发现，经100 mg/L GA3处理的种子和CK相比发芽率并无明显增加，且经低温浸润后再加GA3处理和只经低温浸润相比，种子发芽率明显降低，GA3处理对新铁炮雷山一号的发芽没有明显作用甚至一定程度上抑制了种子的萌发，这与杨炜如等[17]的研究结果有一定的相似处，其认为50 mg/L的赤霉素能抑制岷江百合种子的萌发。究竟是品种间差异还是激素浓度和浸泡时间的不同影响种子萌发，有待进一步研究。

通过试验发现，培养方式不同对种子发芽率有着一定的影响。雷山1号种子用土壤培养和MS培养基无菌培养发芽率较高，接近90%，两者发芽率相差不大，土壤培养的发芽率为89%，MS培养基无菌培养发芽率为88.66%。从经济和时间成本方面考虑，土壤培养方式发芽率高操作简便省时，为最佳培养方式。而添加有NAA的MS培养基培养方式，发芽率为82.66%，激素NAA抑制了种子的萌发。这与崔祺等[18]的试验结果不同，其认为0.01 mg/L的NAA浓度能促进淡黄花百合种子的萌发。发芽率最低的是培养皿播种，结果与郝渊鹏等[6]对新铁炮百合朱丽叶的研究有所出入，可能是品种不同所造成的差异。综合来看，最优的培养方式是土壤培养。

与预处理方式和培养方式相比，培养温度是影响新铁炮百合雷山1号种子萌发的最重要的因素，并且21℃培养的种子活力和发芽率最高，25℃培养的种子活力和发芽率最低，与韩秀丽等[7]研究结果接近，新铁炮百合雷山1号的最适培养温度为20、24℃以上的高温将抑制新铁炮百合种子的萌发。

发芽率仅能反映种子萌发成幼苗的能力，并不能反映种子的健壮程度和对不良环境的抵抗能力[19]。种子萌发期间所需能量主要来源于其自身储藏物质例如可溶性糖的转化和利用[11]。种子的吸涨和萌发过程伴随着活性氧的产生和积累[20]，SOD 可以催化超氧化物自由基和氢离子反应形成过氧化氢和分子氧以消除活性氧的危害[21]。通过对可溶性糖含量和SOD酶活性的测定，试验进一步从储藏物质转化和抗逆能力的角度研究了温度对新铁炮百合种子萌发过程中可溶性糖和SOD活性变化规律的影响，发现21℃培养条件下种子对于可溶性糖的利用和消除活性氧的能力显著高于其它培养温度，进一步证实新铁炮百合品系雷山1号种子萌发的适宜温度为21℃。

4 结 论

培养方式对种子萌发影响最小。培养温度为影响新铁炮百合种子萌发的最重要因素。在4个预处理水平中，新铁炮百合种子经4℃浸种7 d的预处理方式发芽效果最好。 最优培养方式为土壤播种。根据正交试验探究不同预处理方式、培养方式、培养温度对新铁炮百合种子萌发影响是成功的。新铁炮百合雷山1号种子萌发最佳处理组合为预处理方法4℃浸种7 d，培养温度21℃，土壤培养。

不同预处理和培养方法协同作用，土壤培养为雷山1号种子萌发的最佳处理组合，发芽率99.18%，9 d发芽指数4.65；21℃下种子内部的可溶性糖消耗最快，SOD活性最强，是雷山1号的最佳培养温度。