冬青叶中黄酮类化合物提取方法比较研究

李睿

(西安邮电大学 经济与管理学院,陕西 西安 710121)

冬青属于乔木植物，主要生长分布在长江中下游省份[1]。冬青的根、茎、叶都有药用功效，其提取物具有抑菌、消炎、促进血液循环等作用[2]。冬青叶所含化学成分相对复杂，包括黄酮类、三萜类、皂苷、氨基酸等成分[3-4]。黄酮类化合物具有多种药理及生物学活性，具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤、保护心脑血管系统、提高免疫力等作用[4-5]，合理开发利用黄酮类化合物有着重要的药用意义。

本文分别采用水浴提取法[6]、水浴搅拌提取法[7]和微波辅助提取法[8]提取冬青叶中的黄酮类化合物，利用正交实验优化3种方法的提取工艺并做以比较，得出提取冬青叶中黄酮类化合物的最佳工艺。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

冬青叶；芦丁标准品；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、结晶三氯化铝均为分析纯；蒸馏水。

AL204电子分析天平；FZ102微型植物粉碎机；HH-2数显恒温水浴锅；101-3AB电热鼓风干燥箱；RE-52旋转蒸发器；SHZ-D(III)循环水式多用真空泵；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器；752N紫外可见分光光度计；365 nm紫外分析仪。

1.2 实验方法

将新鲜的冬青叶烘干至恒重，粉碎后过筛，得冬青叶干粉。取10 g冬青叶干粉于烧杯中，分别采用水浴提取法、水浴搅拌提取法和微波辅助提取法按照L9(34)正交设计对冬青叶中黄酮类化合物进行单次提取，考察其提取率。提取液浓缩后定容至50 mL，采用硝酸铝比色法测定黄酮类化合物的含量。

1.3 测定方法

1.3.1 标准曲线的制作 精确称取干燥至恒重的芦丁标准样品10 mg(120 ℃干燥2 h)，以70%的乙醇溶解定容至100 mL，摇匀，得到浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。精确吸取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL放入25 mL具塞比色皿中，加5%的亚硝酸钠溶液0.5 mL，静置6 min后加入10%的硝酸铝溶液0.5 mL，静置6 min后再加4%的氢氧化钠溶液5 mL，摇匀，静置15 min，最后以70%的乙醇溶液定容至25 mL。在波长510 nm处测不同浓度芦丁标准溶液的吸光值，得到回归方程为：A=11.867C-0.017 2,R2= 0.999 8(A为吸光度，C为芦丁标准液浓度mg/mL)。

1.3.2 黄酮类化合物含量的测定 吸取1 mL浓缩定容后的提取液，加5%的亚硝酸钠溶液0.5 mL，静置6 min后加10%的硝酸铝溶液0.5 mL，静置6 min后加4%的氢氧化钠溶液5 mL，静置15 min后以蒸馏水定容至25 mL。在波长510 nm处测定吸光值。

2 结果与讨论

2.1 水浴法提取黄酮的最佳工艺

以温度、时间、固液比和乙醇浓度为考察因素，采用水浴提取法提取，选择L9(34)正交设计实验，因素水平见表1，结果见表2。

表1 正交实验因素水平

表2 正交L9(34)实验结果

由表2可知，使用水浴提取法时，影响提取效果的因素顺序为：A>C>D>B，温度对提取率的影响最大。最优化工艺为A2B2C3D2，即提取温度70 ℃，时间120 min，固液比1∶12 g/mL，乙醇浓度60%。

2.2 水浴搅拌法提取黄酮的最佳工艺

以温度、时间、固液比和乙醇浓度为考察因素，采用水浴搅拌提取法提取，选择L9(34)正交设计实验，因素及水平见表3，结果见表4。

表3 正交实验因素水平

由表4可知，使用水浴搅拌提取法时，影响提取效果的因素顺序为A>C≈D>B，提取温度对提取率的影响最大。最优化工艺为A2B1C3D2，即提取温度70 ℃，时间60 min，固液比1∶12 g/mL，乙醇浓度60%。

表4 正交L9(34)实验结果

2.3 微波辅助法提取黄酮的最佳工艺

以温度、时间、固液比和乙醇浓度为考察因素，采用微波辅助提取法提取，选择L9(34)正交设计实验，因素及水平见表5，结果见表6。

表5 正交实验因素水平

表6 正交L9(34)实验结果

由表6可知，使用微波辅助提取法时，影响提取效果的因素顺序为：A>C>B>D，提取温度对提取率的影响最大。最优化工艺为A2B1C1D3，即提取温度70 ℃，时间20 min，固液比1∶8 g/mL，乙醇浓度70%。

2.4 提取方法比较

根据以上3组正交L9(34)实验结果，采用水浴提取法、水浴搅拌提取法和微波辅助提取法按照其最佳提取条件，分别对冬青叶中黄酮类化合物进行单次提取，每组实验做3个重复，取平均值，结果见表7。

表7 提取方法比较

由表7可知，水浴提取法、水浴搅拌提取法和微波辅助提取法的提取率分别为3.96，4.18，4.92 mg/g。水浴搅拌法提取率高于水浴法是因为搅拌减小了分子间的聚集作用，增加了提取液与颗粒之间的接触面积，提高了提取率[9]。微波辅助提取法的提取率最高，是因为微波破坏了冬青叶的细胞结构，有利于细胞中有效成分快速释放到提取液中，提高了提取率，并且大大缩短了提取时间[10]。

3 结论

(1)水浴提取法、水浴搅拌提取法和微波辅助提取法提取冬青叶中黄酮类化合物的最佳工艺为：①水浴提取法：提取温度70 ℃，时间120 min，固液比1∶12 g/mL，乙醇浓度60%；②水浴搅拌提取法：提取温度70 ℃，时间60 min，固液比1∶12 g/mL，乙醇浓度60%；③微波辅助提取法：提取温度70 ℃，时间20 min，固液比1∶8 g/mL，乙醇浓度70%。3种提取方法的最佳工艺条件下的提取率为3.96，4.18，4.92 mg/g。

(2)微波辅助提取法提取率最高，大大缩短了提取时间，但是对实验设备要求较高，水浴搅拌提取法相比水浴提取法提取率提高幅度不大，且水浴提取法操作简便、节约成本，适合工业化大批量生产。