Hippo信号通路中TAZ、YAP在三阴性乳腺癌中的表达及意义

祝景伟，佟经伟，许培权

蚌埠医学院第一附属医院(蚌埠 233004)

Hippo信号通路是近年来首先在果蝇中发现的一条高度保守的抑制性信号通路，通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来调节器官的发育[1]。越来越多的研究表明，该信号通路的异常与多种肿瘤的发生有关[2-6]。具有PDZ结合基序的转录共活化蛋白(Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)和Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)是Hippo信号通路的两个核心下游转录调控分子，在多种肿瘤中存在过表达现象[2-3，7-9]。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受体(Estrogen receptors,ER)、孕激素受体(Progesterone receptors,PR)和人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)均为阴性的乳腺癌。TNBC恶性程度高、侵袭性强、易远处转移、预后差、对内分泌及靶向治疗反应不敏感，目前化疗仍为TNBC患者主要的全身治疗手段。大部分接受化疗的患者面临着毒性难以耐受与治疗后疾病进展的难题，而且转移性乳腺癌在经过几线治疗后，化疗的有效率愈发低下。因此，寻找有效的靶向治疗分子，对TNBC的早期诊断及治疗至关重要。本研究通过免疫组织化学方法检测TAZ、YAP蛋白在TNBC组织中的表达，探讨TAZ、YAP蛋白与TNBC患者的临床病理特征的关系，为TNBC的靶向治疗提供理论依据。

资料与方法

1 一般资料 收集2013年11月至2014年12月蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科收治的TNBC患者30例为研究组，取同期非三阴性乳腺癌(Non-triplenegative breast cancer,non-TNBC)患者30例做对照组。所有患者均为女性，年龄28～72岁，中位年龄47岁。肿瘤体积大小≤2 cm 30例，2～5 cm 26例，>5 cm 4例。无淋巴结转移28例，有淋巴结转移32例。TNM分期：I期15例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例。组织学分级：Ⅰ-Ⅱ级38例，Ⅲ级22例。所有患者术前均未接受过放疗、化疗、靶向及内分泌治疗，入院后经我院病理科确诊为浸润性乳腺癌后行乳腺癌改良根治术。两组患者临床病理资料对比见表1。

表1 两组一般资料对比(例)

2 TAZ和YAP检测 兔抗人TAZ抗体和重组YAP抗体购自美国Abcam公司(ab110239)。所有标本均经10%中性福尔马林固定，采用免疫组织化学标记(SP法)进行检测。石蜡标本常规切片后脱蜡、水化、蒸馏水冲洗，用PBS(pH值=7.4)冲洗3次，每次3 min。高温高压对组织抗原进行修复，冷却至室温，PBS缓冲液浸泡5 min，重复3次。3%过氧化氢室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次3 min。甩去PBS，滴加第一抗体(TAZ抗体/YAP抗体)，4 ℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min，甩去PBS，滴加二抗(根据Abcam公司二抗试剂盒说明书进行操作)，PBS冲洗3次，每次3 min。甩去PBS，滴加DAB显色液，蒸馏水冲洗，进行复染、脱水、透明、自然干燥后封片。

3 结果判断标准 本实验中病理检测结果的判断由我院病理科两名高年资副主任医师担任。TAZ和YAP蛋白表达在细胞核和(或)胞质中，并呈棕黄色颗粒为阳性。随机选取5个高倍镜(200倍)视野，根据细胞着色比例和染色强度进行评价。细胞着色比例：<10%记为0分，10%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分；染色强度：无着色记为0分，淡黄色记为1分，黄色记为2分，棕黄色记为3分。上述两项结果相乘，得分<3为阴性，≥3为阳性。

4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件包进行数据处理，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析法。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 TAZ在三阴性乳腺癌组织和非三阴性乳腺癌组织中的表达 30例研究组癌组织中，TAZ阳性率为56.7%，30例对照组癌组织中TAZ阳性率为16.7%。研究组癌组织中TAZ阳性率高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

A：TAZ在研究组中的阳性表达；B：TAZ在研究组中的阴性表达；C：TAZ在对照组中的阳性表达；D：TAZ在对照组中的阴性表达

表2 两组癌组织中TAZ的表达

2 YAP在三阴性乳腺癌组织和非三阴性乳腺癌组织中的表达 30例研究组癌组织中，YAP阳性率为73.3%，30例对照组癌组织中YAP阳性率为43.3%。研究组癌组织中YAP阳性率高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2、表3。

表3 两组癌组织中YAP的表达

A：YAP在研究组中的阳性表达；B：YAP在研究组中的阴性表达；C：YAP在对照组中的阳性表达；D：YAP在对照组中的阴性表达

3 TAZ和YAP在三阴性乳腺癌组织中的表达与临床病理参数之间的关系 TAZ和YAP的阳性表达均与肿瘤大小和组织学分级有关，差异具有统计学意义(P<0.05)；而与发病年龄、临床病理分期、淋巴及转移情况无关，差异无统计学意义(P>021:00 2020-9-9.05)。见表4。

表4 研究组中TAZ和YAP的表达与临床病理参数的关系

4 TAZ和YAP在三阴性乳腺癌组织中表达的相关性 在研究组中，TAZ和YAP共同阳性表达的有16例，共同阴性表达的有7例。根据Spearman相关分析结果显示，TAZ和YAP蛋白在研究组中的表达呈正相关(r=0.537,P<0.05)。

讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在形态学、分子生物学、临床表现以及治疗反应性上具有高度异质性。TNBC作为乳腺癌的一种亚型，占所有乳腺癌的15%～20%[10]，具有与其他乳腺癌亚型不同的临床病理特征。常表现为：发病年龄较轻、肿瘤直径大、组织学分级高、腋窝淋巴结常阴性、易复发和远处转移、生存时间短等特点[11]，目前尚无标准的治疗方案。本组资料显示，发病年龄最轻(28岁)的发生在研究组，且年龄≤45岁的患者多于对照组；肿瘤直径常>2 cm、淋巴结转移率不高，与以上报道基本一致。

Hippo信号通路在进化上是一条高度保守的抑制性信号通路。1995年，两个实验室在果蝇中运用遗传学筛选寻找肿瘤抑制基因时几乎同时发现了第一个Hippo信号通路成员Wts[12-13]，其主要负责编码NDR(Nuclear Dbf2-related)家族蛋白激酶，Wts突变导致组织过度生长。此后研究发现了Hippo信号通路的其他核心成员，包括Sav(Salvador)、Hpo(Hippo)、Mats(Mob as tumer suppressor)、Yki(Yorkie)。Hippo信号通路的核心成员在哺乳动物中都有相对应的同源蛋白分子，Hpo、Sav、Mats、Wts、Yki在哺乳动物中对应的同源蛋白分别是MST1/2(Mammalian Sterile 20-like kinases 1/2)、SAV1(Salvador homolog 1)、MOB1(MOBKL1A/MOBKL1B)、LATS1/2(Large tumor suppressor kinases 1/2)和转录共激活因子TAZ/YAP。 TAZ和YAP是Hippo信号通路的两个核心下游转录调控分子，属于同源蛋白，具有相似的结构和功能。在上游信号因子的作用下，活化的MST1/2和SAV1磷酸化LATS1/2、MOB1并使其相互结合形成复合物，磷酸化TAZ/YAP，TAZ和YAP在细胞质中被磷酸化后与14-3-3蛋白结合，进一步被泛素化降解，参与正常组织代谢[14-15]；若该通路被阻断或失活，TAZ和YAP在胞质中未被磷酸化则进入细胞核中，与TEA域家族成员(TEA domain family members,TEAD)等转录因子结合，从而调控靶基因的表达，参与非正常的调节与代谢，影响细胞的增殖、凋亡和侵袭[16-17]。

目前研究发现，在乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌和口腔鳞状细胞癌等多种人类肿瘤中都存在Hippo信号通路的异常，表明Hippo信号通路参与肿瘤发生发展的多个环节。TAZ和YAP是Hippo信号通路的两个核心效应分子，研究发现，TAZ在口腔鳞状细胞癌中高表达，且高表达的TAZ与肿瘤大小、病理学分级、淋巴结转移等密切相关[4]；在胃癌中高表达的TAZ可通过促进血管内皮生长因子的表达，进而促进胃癌血管生成的能力[2]；而在非小细胞肺癌中，YAP通过调控长链非编码RNA的表达促进癌细胞的增值和迁移[18]。此外，TAZ和YAP的表达异常与多种肿瘤的耐药密切相关。在非小细胞肺癌中，YAP在吉西他滨、紫杉醇和顺铂等化疗药的耐药中表达异常[19]；在乳腺癌中，过表达的TAZ导致癌细胞对紫杉醇耐药，而沉默TAZ可增加乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性，而且TAZ被用来维持乳腺癌干细胞的特性，并导致这些细胞对紫杉醇和多柔比星的耐药性[20]。本研究结果显示：TAZ在TNBC组织中的阳性表达率为56.7%，高于non-TNBC组织(16.7%)，而YAP在TNBC组织中阳性表达率高达73.3%，也高于non-TNBC组织(43.3%)，提示TAZ和YAP与TNBC的发生发展密切相关；TAZ和YAP在肿瘤直径大于2 cm的TNBC组织中表达较高；TNBC组的组织学分级以Ⅱ、Ⅲ级为主(29/30)，TAZ和YAP在分化较差的组织中阳性表达率高。肿瘤大小、组织学分级是公认的乳腺癌预后因素，TAZ和YAP的表达与其相关，提示TAZ和YAP可能与TNBC的恶性程度高、预后差的特征有一定的相关性。

TNBC恶性程度高、侵袭性强，与其他类型乳腺癌相比具有较差的预后。本文通过免疫组织化学法检测了60例乳腺癌组织中TAZ、YAP蛋白的表达，发现两者高表达于TNBC组织中，且与肿瘤大小、组织学分级有关；另外，在TNBC中TAZ和YAP的表达呈正相关，说明两者在三阴性乳腺癌的发生发展中可能具有相互协同作用。我们可以认为Hippo信号通路在TNBC的发生发展中扮演着重要角色。但本次实验的最大不足是样本量过少，在后续研究中需要进行大样本、多中心统计验证。因此，阐明Hippo信号通路在TNBC发生发展中的作用，为靶向TNBC的治疗提供新的方向。