血清IL-6与中性粒细胞表型及吞噬力关系在脓毒症分期中的诊断价值

董晓玉,马晴晴，殷 俊，李家斌，郑美娟1,,沈继龙1,

脓毒症在住院患者中的高患病率及在重症监护室的高死亡率[1]，使其成为全世界健康问题的主要威胁。脓毒症是宿主对感染的反应失调，引发危及生命的器官功能障碍[2]。脓毒症早期，发热往往是感染的唯一指标。这些患者在发热时常检测白细胞(white blood cell，WBC)计数和分类、超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)和降钙素原(procalcitonin，PCT)等，来辅助判断感染。近年来，很多学者提出“细胞因子风暴”的概念，当机体感染微生物后可迅速诱导免疫细胞释放大量的细胞因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、干扰素(interferon-gamma，IFN)-γ、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17等[3]，这种细胞因子风暴可引起多器官的功能衰竭。该研究利用流式细胞微球阵列术(cytometric bead array，CBA)可快速、便捷地检测细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α，观察其在脓毒症不同感染分期中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2018年1月～2019年6月安徽医科大学附属巢湖医院住院的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)患者95例，年龄33～97(64.61±18.59)岁。有以下2项以上者为SIRS纳入标准：① 体温>38 ℃或<36 ℃； ② 心率>90次/min；③ 呼吸>20次/min或二氧化碳分压<4.25 kPa；④WBC计数>12×109/L， 或 <4×109/L，或幼稚中性粒细胞数>10%。排除并发严重免疫系统疾病、晚期恶性肿瘤、血液系统疾病及年龄<18岁的患者。根据脓毒症3.0版标准[4]，患者在SIRS基础上其序贯性器官功能衰竭评估(sequential organ failure assessment，SOFA)≥2分，诊断为脓毒症。当脓毒症出现无法纠正的低血压且患者血清乳酸水平>2 mmol/L，即可诊为脓毒症休克。据此95例SIRS患者分为非脓毒症患者19例，脓毒症患者56例，脓毒症休克患者20例。另外局部感染组26例(主要是肺部及其它部位感染)，年龄29～76(61.15±19.29)岁；对照组20例(健康体检者)，年龄26～65(45.25±12.03)岁。各组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。入选对象或家属均签署知情同意书。本研究经安徽医科大学附属巢湖医院伦理委员会批准(批号：201801-kyxm-01)。

1.2 实验仪器FACS Calibur流式细胞仪，分析软件为Flowjo7.6，试剂购自美国BD公司CBA试剂盒，检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平；VIDAS电化学发光分析仪，定标品、质控品和试剂均为VIDAS原装配套试剂盒，检测PCT水平；日立7600全自动生化分析仪，试剂、定标品和质控品均为利德曼配套试剂盒，检测hs-CRP水平；Sysmex2100全自动血细胞分析仪，质控品和试剂均为Sysmex原装试剂，进行WBC计数和分类；CD62L、CD64和CD11b检测 FACSCalibur流式细胞仪，分析软件为Flowjo7.6；试剂为PE-CD64、FITC-CD62L、PE-CD11b、PerCP-CD45及其同型对照，红细胞裂解液均购自美国BD公司。检测各分子的平均荧光强度(median fluorescence intensity，MFI)，同时计算外周血中性粒细胞(peripheral blood neutrophils，PBNs)表面簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)62L指数(即中性粒细胞CD62L MFI /淋巴细胞CD62L MFI)，CD11b 指数和CD64 指数均做相同计算处理。

1.3 方法

1.3.1标本采集 患者出现发热24 h内静脉血2 ml乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝用于WBC计数和PBNs CD64、CD11b、CD62L分子检测；1 ml 枸橼酸钠抗凝血用于中性粒细胞吞噬功能实验；3 ml肝素抗凝血离心(4 000 r/min，5 min)后取血清-80 ℃冻存以备检测PCT、hs-CRP、细胞因子。

1.3.2中性粒细胞吞噬功能试验 取1 ml枸橼酸钠抗凝血，加入3～5滴金黄色葡萄球菌悬液(2.0麦氏浓度)，混匀，置37 ℃水浴箱中，孵育30 min，每10 min摇匀1次。制备血涂片并瑞吉氏染色，计算吞噬了金黄色葡萄球菌的中性粒细胞吞噬百分率(吞噬细菌的中性粒细胞数/计数的中性粒细胞总数)、吞噬指数(计数的中性粒细胞吞噬细菌总数/计数的中性粒细胞总数)。

2 结果

2.1 对照组与局部感染组、SIRS组患者细胞因子的水平对照组与各实验组以及各实验组之间比较，细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图1A、1B、1E、1F。细胞因子IL-6在三组患者中的水平依次为SIRS组>局部感染组>对照组(F=21.696，P<0.01)，见图1C；细胞因子IL-10在三组患者中的水平依次为SIRS组>局部感染组>对照组(F=23.328，P<0.01)，见图1D。IL-6、IL-10是反映SIRS的有效指标。

2.2 非脓毒症组、脓毒症组、脓毒症休克组患者血清IL-6、IL-10水平的比较及诊断效能分析观察血清IL-6和IL-10水平在脓毒症诊断和分期中的价值，血清IL-6在三组患者中的水平依次为脓毒症休克组>脓毒症组>非脓毒症组(F=46.892，P<0.01)，见图2A。脓毒症休克组和脓毒症组患者血清IL-10水平高于非脓毒症组(F=13.077，P<0.01)，而脓毒症休克组与脓毒症组之间患者血清IL-10水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图2B。利用ROC曲线分析血清IL-6、IL-10水平在脓毒症休克的诊断价值，见图2C、表1，血清IL-6在脓毒症休克的诊断效能大于IL-10。

2.3 IL-6水平高低两组脓毒症患者各其余炎性指标的比较依据脓毒症休克IL-6最佳截断值995.46 pg/ml, 将脓毒症和脓毒症休克患者分为高IL-6组和低IL-6组，比较两组患者其余炎性指标。高IL-6组患者血清hs-CRP、PCT、IL-6、IL-10水平均高于低IL-6组(P<0.01)，而两组之间WBC计数、PBNs计数比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。高IL-6组患者同时高表达炎性标志物。

表1 IL-6和IL-10在脓毒症休克中的诊断效能分析

2.4 IL-6水平高低两组脓毒症患者中性粒细胞表型的表达检测IL-6水平高低两组脓毒症患者PBNs表面CD62L、CD64和CD11b分子，其MFI的表达，结果见图3A、B、C。低IL-6组和高IL-6组PBNs CD62L指数差异无统计学意义(P>0.05)，见图3D。高IL-6组PBNs CD64 指数高于低IL-6组(t=3.189，P<0.01)，PBNs CD11b 指数高于低IL-6组(t=2.711，P<0.01)，见图3E、3F。

2.5 IL-6水平高低两组脓毒症患者中性粒细胞吞噬功能的比较比较IL-6水平高低两组脓毒症患者中性粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌功能，高IL-6组脓毒症患者的中性粒细胞吞噬百分率高于低IL-6组(t=4.311，P<0.01)，吞噬指数亦高于低IL-6组(t=3.067，P<0.01)，见图4。高IL-6组脓毒症患者中性粒细胞的吞噬功能更为活跃。

图1 对照组、局部感染组与SIRS组的细胞因子水平的比较

图2 非脓毒症组、脓毒症组、脓毒症休克组血清IL-6和IL-10水平的比较及诊断效能分析

表2 低IL-6组和高IL-6组患者各检测指标的比较

图3 IL-6水平高低两组脓毒症患者PBNs CD64、CD11b、CD62L平均荧光强度的表达及指数的比较

3 讨论

脓毒症是由细菌感染引起SIRS的持续发展、不断恶化的动态过程。其病理生理过程中，细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是主要诱因。LPS可激活免疫细胞释放大量细胞因子，旨在清除病原菌。而细胞因子的过度释放会引起强烈的免疫应答，影响病程和预后。

本研究显示，血清IL-6和IL-10水平：脓毒症组>SIRS组>局部感染组，IL-6和IL-10可作为脓毒症诊断的良好指标。IL-6是细胞因子风暴的核心成员，一般细菌感染1 h后血液IL-6水平迅速升高，2 h 即达到高峰。机体感染时，血清IL-6水平迅速升高，IL-6是参与SIRS、脓毒症及并发多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要细胞因子[5]。许多研究[6-7]表明，血清IL-6水平对脓毒症早期诊断具有很高的敏感性和特异性。脓毒症患者在炎症介质大量释放的同时，亦伴随体内抗炎因子的释放，而IL-10是辅助性Th2(T-helpercell 2)细胞等分泌的强效抗炎因子，可抑制IL-1、IL-6、IL-8以及TNF-α等因子的释放。有研究[8]表明血清IL-10水平随着脓毒症患者IL-6水平升高而调控性的升高，且IL-6和IL-10与脓毒症患者的病情和预后相关[9]。本研究中，脓毒症时血清IL-6、IL-10水平升高，高达正常值的数百、数千倍。Sapan et al[10]报道，脓毒症患者并发MODS时，血清IL-6和IL-10水平会进一步升高。本研究显示脓毒症休克患者血清IL-6水平高于脓毒症组，而两组间血清IL-10水平比较差异无统计学意义，同时脓毒症休克的ROC效能分析，显示IL-6曲线下面积、灵敏度、特异度分别为0.882、85.00%、80.40%，均高于IL-10，这与Jekarl et al[11]报道的结果相似。可见，相较于IL-10，血清IL-6水平对于脓毒症的诊断和分期更具价值，这可能与IL-6的过量表达造成组织器官的损伤及功能障碍有关。以IL-6最佳截断值995.46 pg/ml，将脓毒症及脓毒症休克患者分为高IL-6 组和低IL-6 组，结果显示高IL-6组血清hs-CRP、PCT、IL-6、IL-10水平均高于低IL-6组。可见高IL-6组脓毒症患者的其它炎性指标同时升高；而外周血WBC计数、PBNs计数比较差异无统计学意义，这可能与重症感染时，WBC有时会左移相关。感染时除了细胞因子的作用，占外周血白细胞总数50%～70%的PBNs，其活化、吞噬、杀菌的固有免疫功能亦发挥强大作用。病原体感染后，CD64、CD11b和CD62L等黏附或趋化因子表达上调，激活PBNs。Aydinl et al[12]曾报道，脓毒症时PBNs CD11b、CD64分子高表达，而CD62L未见明显升高，本研究结果与之相似。一份Meta分析[13]显示PBNs CD11b可作为新生儿脓毒症的早期诊断指标，且与疾病的严重程度相关。有报道[14]CD64指数联合IL-6检测能提高血液科发热患者血培养阳性的灵敏度。本研究比较了PBNs CD62L指数、CD64指数、CD11b指数，而不单纯使用这些分子的MFI或阳性细胞表达百分比，是为了减少阴性对照的淋巴细胞和人为因素的误差。比较显示高IL-6组PBNs CD11b和CD64表达均高于低IL-6组，同时高IL-6组脓毒症患者中性粒细胞吞噬功能高于低IL-6组。这可能与炎症持续，中性粒细胞仍处于免疫活化状态相关，此结果与高IL-6组患者伴随PBNs CD64、CD11b高表达相一致。

图4 IL-6水平高低两组脓毒症患者中性粒细胞吞噬率和吞噬指数的比较

综上所述，脓毒症患者血清IL-6和IL-10水平显著提高，脓毒症休克患者血清IL-6水平进一步升高，高IL-6水平同时伴有中性粒细胞的免疫活性增强，中性粒细胞高表达CD64、CD11b分子及高吞噬力。血清IL-6是脓毒症诊断和分期的有效指标。脓毒症时动态监测血清IL-6水平可为脓毒症临床诊断、疾病进展提供依据，值得在临床推广。