梯棱羊肚菌菌丝培养条件

李岩龙

（1.甘肃省白龙江林业管理局林业科学研究所，甘肃 陇南 746010；2.甘肃白龙江森林生态系统国家定位观测研究站，甘肃 舟曲 746300）

羊肚菌为子囊菌亚门盘菌纲羊肚菌科羊肚菌属真菌的总称[1]，主要分布于北半球，是世界上最受欢迎的食用菌之一，在我国主要分布在云南、四川、陕西、甘肃、青海、西藏、新疆、山西、内蒙古、辽宁等地，因菌盖部分凹凸成蜂窝状，形状酷似翻开的羊肚（胃）而得名。羊肚菌不仅营养丰富，味美可口，而且是一种重要的药用真菌，主治精肾亏损，对头晕失眠、肠胃炎症等有良好的治疗作用[2]，但价格昂贵，而野生资源又远远不能满足需要，羊肚菌的人工驯化栽培一直是羊肚菌研究的热点之一。为了筛选适合当地的栽培种，我们引进了梯棱羊肚菌Morchella importuna 菌株，研究培养基、培养温度、酸碱度、碳源和氮源等条件要求，旨在为羊肚菌的人工种植提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

供试菌种梯楞羊肚菌M6613 菌株由中国科学院昆明植物所提供。

1.2 培养基

试验共采用7 种培养基，除培养基I 为PDA培养基外，其他6 种均为复合培养基。

PDA 培养基（I）：马铃薯200 g 洗净去皮切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤取过滤液（下同）；过滤液，葡萄糖20 g，琼脂15 g，加热搅拌混匀，稍冷却后加蒸馏水至1 000 ml，pH 值6.5，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121 ℃灭菌20 min（下同）；

PDA 麸皮培养基（II）：马铃薯过滤液，葡萄糖20 g，琼脂15 g，麸皮浸泡液60 ml，加热搅拌混匀，稍冷却后加蒸馏水至1 000 ml，pH 值6.5；

PDA 玉米培养基（III）：马铃薯过滤液，葡萄糖20 g，琼脂15 g，玉米粉浸泡液60 ml，加热搅拌混匀，稍冷却后加蒸馏水至1 000 ml，pH 值6.5；

PDA 土壤培养基（IV）：马铃薯过滤液，葡萄糖20 g，琼脂15 g，土壤浸泡液60 ml，加热搅拌混匀，稍冷却后加蒸馏水至1 000 ml，pH 值6.5；

PDA 综合培养基（V）：马铃薯过滤液，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1g，VB150 μg，琼脂15 g，加热搅拌混匀，稍冷却后加蒸馏水至1 000 ml，pH 值6.5；

MYG 培养基（VI）：麦芽浸膏5 g，酵母膏4 g，葡萄糖10 g，淀粉15 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂15 g，加热搅拌混匀，稍冷却后加蒸馏水至1 000 ml，pH 值6.5；

基础培养基（VII）：葡萄糖12 g，KNO31.85 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，FeCl30.01 g，VB1 100 μg，琼脂20 g，加热搅拌混匀，稍冷却后加蒸馏水至1 000 ml，pH 值6.5。

1.3 菌种制备

将活化后的菌株的纯培养物分别接种于PDA平板中央，于20±1 ℃恒温条件下暗培养2～3 d，当菌丝生长至培养皿边缘时进行接种。

1.4 试验方法

采用平板培养法，通过测定不同培养条件下培养基中菌丝的生长速度、菌丝生长势和菌核情况来考察供试条件对菌丝和菌核生长的影响。试验均采用9 cm 培养皿，培养基用量为每皿20 ml，培养皿中央定量接种8 mm 的菌饼1 块，在(20±1)℃，相对湿度70%～75%下暗培养，试验均设置5个重复。采用划线法每隔8 h 测1 次菌落直径，共培养2～3 d，计算菌丝生长速率。

1.5 温度和酸碱度

温度：选用PDA 培养基，将菌种块接种于PDA 培养基平板中央，然后分别放置于5、10、15、20、25、30、35 ℃等7个不同温度处理下恒温培养，每隔8 h 观测1 次，记录菌丝生长速度、生长势和菌核情况。

酸碱度试验：配制PDA 培养基并灭菌，在无菌条件下用灭菌的0.2 mol/L 的NaOH 溶液和0.2 mol/L 的HCl 溶液调节的酸碱度，试验设置pH 值5.0、5.5、6.0，6.5、7.0、7.5、8.0 等7 个酸碱度处理。

1.6 碳源和氮源

碳源试验：以基础培养基中12 g 葡萄糖的含碳量为标准，分别以相等含碳量的蔗糖（10.4 g），麦芽糖（10.9 g），可溶性淀粉（9.8 g），甘油（8.4 g），甘露醇（11.0 g），代替基础培养基中的葡萄糖；氮源试验：以基础培养基中1.85 g KNO3的含氮量为标准，分别以相等含氮量的尿素（1.53 g），蛋白胨（5.71 g），(NH4)2SO4（3.37 g），NH4NO3（2.04 g），NaNO4（4.34 g）代替基础培养基中的KNO3，其他成分同基础培养基。

2 结果与分析

2.1 不同培养基的影响

供试菌株在各种复合培养基上均能生长并产生菌核，其中，菌丝在PDA 综合培养基上生长速度最快，生长速度达到15.69 mm/d，生长势也很好，其次是PDA 土壤培养基，生长速度为14.47 mm/d，其他几种复合培养基上菌丝生长速度相差不大，均在13.22～13.99 mm/d 之间；最适合菌核形成的培养基是PDA 麸皮培养基。

表1 不同培养基对生长的影响

2.2 不同温度的影响

不同温度对菌株菌丝的生长速度、生长势及产核等有着明显的影响（表2）。菌丝在5～30 ℃下均能生长，35 ℃时菌丝生长被抑制，菌核在5～25 ℃的温度范围内就能形成，30 ℃和35 ℃时供试菌株不形成菌核，25 ℃时形成菌核的数量明显少于5 ℃和10 ℃，表明菌核形成的温度范围窄于菌丝生长的温度范围，相对于菌丝生长，低温更有利于菌核的形成；在试验温度范围内，20 ℃时菌丝生长的速度最快，长势最好，形成的菌核也最多，因此，20 ℃是供试菌株菌丝生长和菌核形成的最适温度。

表2 不同温度对菌株生长菌株生长和菌核形成的影响

2.3 不同酸碱度的影响

在pH 值5～8 的条件下，供试羊肚菌的菌丝均可生长，生长速度随酸碱度的变化呈单峰状，峰值出现在pH 值6.5，即pH 值6.5 是该菌种菌丝生长的最适酸碱度；菌丝生长速度、生长势和菌核形成的数量在pH 值6～7 范围内明显好于其他pH 值，说明该菌株适宜在弱酸性的环境中生长。

表3 不同PH 值对菌株生长和菌核形成的影响

2.4 不同碳源的影响

菌丝在不同碳源培养基上均能生长，且都能产生菌核，其中，在氮源为蔗糖和葡萄糖的培养基生长速度最快，分别为13.29 mm/d 和13.14 mm/d，生长势也最好，形成菌核较多，氮源为甘露醇时菌丝生长缓慢且长势较差（表4），表明该菌株菌丝生长和菌核形成的最适氮源是蔗糖和葡萄糖，菌株对甘露醇利用效果较差。

表4 不同碳源对菌株生长和菌核形成的影响

2.5 不同氮源的影响

供试菌株能利用多种氮源，但不同氮源对菌丝生长和菌核的形成影响很大，菌丝在KNO3和NaNO3为氮源的培养基上生长速度最快，KNO3为氮源时的菌丝生长势明显好于NaNO3，尿素为氮源的培养基中菌丝生长最慢，(NH4)2SO4和NH4NO3等铵盐为氮源时菌丝生长缓慢，说明菌丝生长的最适的氮源是KNO3，尿素对菌丝生长有抑制作用，铵盐对菌丝生长也有一定的影响，该菌株不能很好地利用铵盐；菌核在以KNO3和蛋白胨为氮源是形成的最多，以(NH4)2SO4和NH4NO3等铵盐为氮源不形成菌核。

表5 不同氮源对菌株生长和菌核形成的影响

3 结论与讨论

7 种复合培养基中梯棱羊肚菌M6613 菌株的菌丝均能正常生长且都能形成菌核，最适菌丝生长的复合培养基为PDA 综合培养基和PDA 土壤培养基，最适菌核形成的复合培养基为PDA 麸皮培养基；M6613 菌株菌丝生长和菌核形成的最适温度20 ℃，最适酸碱度为pH 值6.5；最适菌丝生长和菌核形成的碳源为蔗糖和葡萄糖，尿素对菌丝的生长有抑制作用，(NH4)2SO4和NaNO4等铵盐存在时，菌丝生长缓慢；最适菌丝生长的氮源为KNO3，最适菌核形成的氮源为KNO3和蛋白胨，氮源为(NH4)2SO4和NaNO3等铵盐时，不形成菌核。

供试菌株在5～20 ℃的温度范围内，随着温度的上升，菌丝生长势越来越好，长速越来越快，温度超过20 ℃时，随着温度上升，菌丝生长减慢，35 ℃时，菌丝停止生长，20 ℃是菌丝生长的最适温度，这和陈芳草等[3]和朱斗锡等[4]结果大致相同，与秦晓波等[5]，薛迎迎等[6]（最适温度为25 ℃）和江洁等[7]（最适温度为28 ℃）结果不一致。大致来说，18～25 ℃是比较适宜的菌丝生长温度，低于2 ℃或高于34.5 ℃，菌丝生长受到抑制[8]。供试菌株在15～20 ℃是容易形成菌核，且形成菌核的数量最多，与刘兴蓉等[9]研究结果一致，与谢方等[10]（最适温度为20～30 ℃）的结论不符，可能与选用的中温菌株有关。温度是影响羊肚菌菌丝生长的主导因素[11]，不同研究者在不同的羊肚菌菌种或菌株试验中得出适宜温度并不相同，可能是不同菌种或菌株对温度的耐受性不同，也可能是在长期进化过程中对当地生态环境的适应[10]。

碳源和氮源对羊肚菌菌丝生长和菌核的形成有重要的作用[12]，本实验中蔗糖、葡萄糖是最适合菌丝生长的碳源，与大多是研究结论一致[8,13]，KNO3和NaNO3是较好的氮源，但是铵盐对菌丝生长有影响，生长速度明显降低，抑制菌核形成，尿素对生长的作用很差，这与董雪[14]硝酸KNO3和NaNO3是羊肚菌生长较好氮源，尿素、(NH4)2SO4和NH4NO3作用效果较差的结论一致，也和李青[15]尿素作用效果差和朱永真等[16]认为羊肚菌对铵根离子利用效果差的结论一致，但与刁治明等[17]和任佳梅等[18]研究结果不同，他们认为尿素是羊肚菌菌丝生长的最优氮源，各个研究者在最佳氮源和碳源的研究中得出的结论差异很大，可能与羊肚菌不同种类及其菌株对营养的利用不用，也可能与羊肚菌的产地有关，不同的生长环境导致其对营养的利用不同[15]。

羊肚菌不同菌株的生物学特性差异较很大[10,19]，这种差异是不同菌种或菌种本身遗传多样性所致，还是种类或菌株对不同生长环境的适应，还需进一步研究确定，从而为培育羊肚菌人工栽培的高产、稳产的菌种提供依据。