心肌组织、耳缘静脉给予养心通脉方剂含药血清内皮祖细胞混悬液的AMI兔心功能观察

朱智德，卢健棋，庞延，温志浩，梁逸强，韩景波，彭志林，林浩

1广西中医药大学，南宁 530023；2广西中医药大学第一附属医院

急性心肌梗死(AMI)是一种冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起心肌坏死的急危病症，及时进行犯罪血管血运重建是治疗本病重要手段。尽管目前经皮冠状动脉介入治疗(PCI)得到广泛开展，但术后仍有半数患者存在心肌微循环灌注甚至无复流等不良事件，严重影响心功能恢复，这与血管内皮细胞受损及血管微循环障碍密切相关[1～3]。内皮祖细胞(EPCs)能够通过旁分泌机制调节血管修复和生成改善微循环，并且能够保护和补充受损内皮细胞有效改善心功能，EPCs移植在改善AMI预后具有潜在的应用前景[4]。养心通脉方剂是我院全国名老中医李锡光主任治疗冠心病有效经验方，我们前期研究证实以10%浓度养心通脉方剂含药血清干预96 h能够显著增强EPCs增殖、迁移、黏附能力[5]。本研究将养心通脉方剂含药血清EPCs移植到AMI兔体内，观察其对AMI兔血管新生密度及心功能影响，以期为中医药联合干细胞移植治疗AMI提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性家兔39只，12周龄，体质量2.0～2.2 kg，由广西医科大学动物实验中心提供。

1.2 主要药物、试剂及仪器 养心通脉方剂(红参、麦冬、五味子、当归、川芎、白术、桂枝、炙甘草、黄芪、白芍、丹参、木香、檀香)购于广西中医药大学第一附属医院，以传统工艺煎煮浓缩，最终生药浓度为1.66 g/mL。兔骨髓淋巴细胞分离液(天津灏洋公司，批号：2013LRA)，PBS缓冲液(维森特公司，批号：311-010-CL)，人纤维连接蛋白(HFN，美国Roche，批号：1105140700)，胎牛血清(FBS，Hyclone，批号:SV30087.01)，EPCs专用培养基(EGM-2，Lonza，批号：CC-3202)，胰酶(Hy Clone，批号：SH30042.01B)，戊巴比妥钠(Serve，批号：201505)，CCK-8试剂盒(日本同仁公司，批号：EJ875)，全波长酶标仪(ThermoFisher，型号：1510)，小动物呼吸机(CKENT SCIENTIFIC ORPORATION公司，型号：RSP-1002)，EGC-6511型心电图机(上海光电医用电子仪器厂)，便携式彩色超声诊断仪(SonoSite，型号：WK2M17)。

1.3 养心通脉方剂含药血清、EPCs及混悬液制备 ①养心通脉方剂含药血清制备：取兔1只，灌胃给予8 mL/(kg·d)养心通脉方剂，剂量参照《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》[6]，2次/d，连续5 d，末次给药后半小时于兔颈总动脉无菌取血，离心并分离血清，56 ℃水浴30 min灭活，-20 ℃保存备用。②EPCs制备[5,7]：另取兔3只，耳缘静脉麻醉后从股骨干抽取骨髓组织，密度梯度离心法获取单个核细胞(MNC) ，并逐步离心洗涤MNC，将 MNC以含10% FBS的EGM-2培养基悬起并调整细胞密度，再接种到预先用HFN(5 μg/cm2)包被的25 cm3培养瓶中培养。培养48 h后首次半量换液，以后3 d换全液1次以淘汰不贴壁细胞，将原代贴壁细胞经体外诱导分化培养16 d后，通过EPCs特异性标志物(CD34)对EPCs进行鉴定后，培养到第20天的EPCs用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，消化重悬并调整细胞密度至5×105/mL。③养心通脉方剂含药血清EPCs混悬液制备：将10%养心通脉方剂含药血清置入含10%FBS的EGM-2培养基培培养96 h，制作成养心通脉方剂含药血清EPCs培养液[5]。

1.4 实验动物分组、AMI模型制备及养心通脉方剂EPCs混悬液移植方法 35只雄性SPF级兔随机分为7组各5只。A、B、C、D、E组均参照文献[8]方法(结扎冠状动脉)制备AMI模型；A、B组制模15 min后，再次打开胸腔，每点吸取混悬液250 μL(A组给予养心通脉方剂EPCs混县液，B组给予EPCs，均为8×105/mL)分别于结扎区附近心肌组织分5点注射，关闭胸腔；C、D组制模后即刻经耳缘静脉注射混悬液1 mL(C组给予养心通脉方剂EPCs混县液，D组给予EPCs，均为1×107/mL)；E组仅制模，不干预;移植后连续注射青霉素3 d预防感染。F组只开胸穿线，不结扎左冠状动脉前降支，耳缘静脉注射1 mL生理盐水。G组不作处理。

1.5 兔心脏彩超相关指标检测 各组于制模后2周进行心脏彩超检测。实验动物麻醉后取平卧位，剪去胸前区毛，涂耦合剂，采用二维超声心动图，选用9 MHz高频矩阵探头进行检测，检测指标包括左室舒张末期内径(LVDd)、左室收缩末期内径(LVDs)、射血分数(EF)，切面选取及超声测量依据美国超声心动图学会制定的标准，取5个心动周期的平均值。

1.6 兔梗死心肌区和缺血心肌区CD34阳性反应强度观察及血管新生密度计算 术后14 d处死各组动物，取出心脏，用冰冷生理盐水冲洗干净，取梗死心肌区、缺血心肌区组织切片并制作石蜡切片保存，取切片常规脱蜡后，采用Envision法行CD34免疫组化染色，用图像分析系统进行定量分析，染色呈棕黄色为阳性，阳性反应强度=阳性反应面积/平均光密度。在低倍镜下选择CD34标记的新生血管高密度区域，100倍镜下计数3个视野，取平均值，管腔大于8个红细胞直径的血管不计在内，计算心肌组织不同区域新生血管密度。

2 结果

2.1 各组LVDs、LVDd、EF比较 LVDs、LVDd、EF比较见表1。

表1 各组LVDs、LVDd、EF比较

2.2 各组梗死心肌区和缺血心肌区CD34阳性反应强度、血管新生密度比较 梗死心肌区和缺血心肌区CD34阳性反应强度、血管新生密度比较见表2。

表2 各组梗死心肌区和缺血心肌区CD34阳性反应强度、血管新生密度比较

3 讨论

AMI常常引起心肌缺血、缺氧，导致心肌内皮细胞凋亡，并诱导血管内皮肿胀和微血管痉挛，甚至引起毛细血管阻塞，当缺血时间>20 min后，内皮细胞开始快速肿胀变形，引起冠脉微血管缩舒反应能力丧失，心外膜血流恢复减缓或微循环血流阻断，导致心肌损伤心功能严重下降[9]。因此，阻止损伤心肌内皮细胞凋亡、补充促进内皮细胞生成分化和促进心肌血管再生改善心肌灌注是PCI术等治疗手段以外重要的辅助治疗策略。EPCs是来源于人体骨髓、外周血管的内皮细胞前体细胞，研究发现体外培养的人体外周血EPCs根据培养时限不同其作用机制也不同，其早期(1周)培养的EPCs主要通过表达促血管生成因子如VEGF、趋化因子3/4/18、细胞趋化因子12/16和募集、促进循环系统中成熟内皮细胞增殖发挥血管新生作用，而晚期(2～4周)培养的EPCs主要通过增殖分化成内皮细胞直接发挥改善心功能作用[10]。此外相关研究证实，EPCs不管是经心内膜注射移植或经冠状动脉移植均能够明显促进新生血管生成而改善心功能和减少心肌梗死面积作用，并且能够有效减轻冠心病心绞痛和心衰症状以及具备一定预防PCI术后支架再狭窄能力[11～13]。EPCs移植具有巨大研究潜力，但如何发挥移植EPCs治疗AMI最大效能目前仍是一个重大挑战。

中医药防治冠心病已有多年的研究历史，《素问·痹论》曰:“心痹者，脉不通”，明确指出血瘀致心脉闭塞不通。《景岳全书》曰：“气血虚寒，不能营养心脾者，最多心腹痛证”，说明气血虚弱，不能濡养心脉而发心痛。《医林改错》曰：“元气既虚，必不能达于血管，血气无力，并停留于瘀”，提出气虚不能推动血液运行，气血运行不畅，血脉凝滞，不通则痛，而发心痛，说明气虚血瘀是冠心病的重要病理基础。养心通脉方剂是全国名老中医李锡光主任治疗冠心病经验方，此方寓通于补，通补兼施，是标本兼治的有效验方，方中人参有大补元气，为君药；黄芪、白术甘温，助人参以补肺健脾，白芍、麦冬、五味子、炙甘草酸甘化阴，养阴敛肺，助人参以益心复脉，同为辅药；当归、丹参、川芎养血活血，祛瘀通脉，檀香、木香、桂枝芳香温通、行气活血，同为佐使药。诸药配伍，具有益气养阴、活血祛瘀、养心通脉之功效，在临床上取得了良好的疗效，具有促血管生成，保护血管内皮功能以及改善心功能作用[14～16]。本研究显示，养心通脉方剂含药血清EPCs移植治疗AMI具有促进梗死心肌区及缺血心肌区血管新生作用，有效改善AMI后心功能，提示中医药联合干细胞移植治疗AMI具有一定优势；同时研究结果亦提示，耳缘静脉注射与心肌注射移植疗效上并无明显差异。

总之，养心通脉方剂含药血清EPCs可能通过促进血管新生进而改善心功能，耳缘静脉注射与心肌注射效果相似。