喉癌患者术后复发与COX-2 表达的关系研究

代文意，魏鑫鑫

（南阳市中心医院，河南 南阳473009）

喉癌时咽喉部常见的恶性肿瘤,虽然目前喉癌的根治性手术切除率及综合治疗措施有明显的进步,但是术后肿瘤的复发仍然是影响患者生存期的最主要的原因[1]。与喉癌复发转移的相关因素较多,在具有相关临床高危因素的患者中,喉癌术后复发导致的患者病情进展的风险更高,而且复发后肿瘤进展的更快[2]。 通过对相关的高位因素的分析，进而对喉癌术后复发进行预测,能够为喉癌的临床治疗提供参考。 喉癌复发转移与肿瘤细胞增殖、转移相关的细胞因子关系极为密切,环氧化酶-2（COX-2）是前列腺素合成过程中的限速酶，在正常状态处于低表达状态，而生长因子、炎症介质及促癌基因等能够诱导COX-2 的表达，COX-2 能够诱导氧化应激反应,加剧游离自由基对于癌细胞核基因的整合,提高上皮细胞核DNA 的分裂速度[3,4]。 COX-2能够提高癌细胞粘附能力,促进癌细胞对于基底膜组织的浸润,最终影响到喉癌的复发转移[5]。为了揭示COX-2 蛋白的表达与喉癌患者的病情关系，从而为临床上喉癌的诊疗提供参考,本次研究选取2 013 年1 月-2015 年8 月我院实施手术治疗的喉癌患者81 例,探讨了COX-2 蛋白的表达及其与喉癌患者的病情关系,分析了喉癌术后复发的高危因素，报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象选取 2013 年1 月-2015 年8 月我院实施手术治疗的喉癌患者81 例，对患者进行3 年随访，根据是否发生局部复发分为复发组27 例和未复发组54 例。 复发组，患者年龄42~71 岁，平均56.1±10.4 岁；性别构成：男17 例、女10 例。未复发组，患者年龄38~75 岁，平均58.0±11.5 岁；性别构成：男38 例、女16 例。 两组患者的年龄、性别情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 相关标准 诊断标准：喉癌患者的诊断参考中华医学会制定的标准[6]；纳入标准：⑴经病理学检查证实；⑵在我院接受手术治疗；⑶术前无放化疗史；⑷均为原发性喉癌；⑸本研究符合《赫尔辛基宣言》相关医学伦理规定。 排除标准：⑴合并其他部位的恶性肿瘤；⑵病理诊断不明确；⑶伴有免疫系统疾病；⑷未能参与术后随访；⑸因其他疾病导致死亡。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色技术 采用石蜡切片, 脱水操作后采用3%H2O2室温条件下孵育20min， 磷酸盐缓冲液清洗3 次，每次5min，磷酸盐缓冲液稀释后的山羊血清封闭抗体5min，倒去血清后不清洗，加入一抗(购自赛默飞世尔中国1:1000)5ml,37℃孵育2h，或者放置4℃冰箱过夜孵育，磷酸盐缓冲液清洗3 次,每次5min,加入生物素荧光标记的二抗（购自赛默飞世尔中国1:2000）3ml,37℃孵育20~30 min,磷酸盐缓冲液清洗3 次,每次5min,加入Streptavidin/HRP 辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育20~30min，磷酸盐缓冲液清洗3 次，每次5min，增强型HRP-DAB 底物显色试剂盒(PA110)显色，自来水冲洗，复染，封片。

1.3.2 免疫组化读片 免疫组化结果判定：COX-2蛋白的阳性着色表达于细胞质，呈黄色、棕黄色、褐色表达，⑴根据着色强度：0 分为无色、1 分为淡黄色、2 分为棕黄色、3 分为褐色、黑色；⑵根据阳性细胞比例： 阳性细胞数目所占比例≤10%为1分、阳性细胞所占比例11%～50%为2 分、阳性细胞数51%～75%为3 分、阳性细胞数所占比例>75%为4 分，两种积分相乘总分<3 分为阴性、≧3 分为阳性；总分<3 分, “-”表达；为3～5 分，“+”表达；为6～9 分，“++”表达；>9 分，“+++”表达。

1.4 统计分析 本研究中所有数据的分析均采用SPSS21.0 版本，年龄采用x±s 表示，组间比较采用t检验；COX-2 蛋白阳性表达率组间比较采用秩和检验或χ2检验；多因素分析采用Logistic 回归分析法；P<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 复发组和未复发组患者的COX-2 蛋白表达对比 经秩和检验分析，复发组患者手术后喉癌组织中的COX-2 蛋白表达强度显著高于未复发组患者，差异具有统计学意义（P<0.05）；见表1。

表1 复发组和未复发组患者的COX-2 蛋白表达对比[n（%）]

2.2 复发组和未复发组患者的病理学特征对比复发组患者的低分化占比、发生淋巴结转移率均高于未复发组的患者,差异具有统计学意义(P<0.05)；复发组和未复发组患者的TNM 分期、肿瘤位置分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)；见表2。

表2 复发组和未复发组患者的病理学特征对比

2.3 影响喉癌患者术后复发的多因素分析 采用Logistic 回归分析，以术后是否复发作为因变量，结果2.1 及2.2 中具有统计学意义的分化程度、淋巴结转移、COX-2 表达情况作为自变量，结果显示分化程度越低、发生淋巴结转移、COX-2 阳性表达是喉癌患者术后复发的独立危险因素(P<0.05);见表3。

表3 影响喉癌患者术后复发的多因素分析

3 讨论

喉癌术后复发与多种因素有关,其中肿瘤的恶性生物学行为与术后复发转移的发生关系最为密切[7]。 有研究显示[8]，在具有组织分级恶化或者增殖指数KI-67 明显上升的喉癌患者中，其3 内或者5内的复发风险可超过15%以上。 临床上复发的喉癌患者,其无瘤生存时间及无进展生存期均明显的缩短,肿瘤恶病质或者多发远处转移的风险也明显上升[9]。 因此较早的对喉癌复发转移风险进行评估并加以干预, 对于改善患者的预后具有积极的作用。 鳞状上皮细胞抗原对喉癌的复发具有一定的预测价值, 但其预测的漏诊或者假阳性率仍然较高,预测的可参考性并不高。 COX-2 蛋白是与肿瘤恶性生物学行为密切相关的细胞因子,其与肿瘤的增殖及侵袭能力密切相关。 COX-2 蛋白对于肿瘤细胞膜稳定性的破坏作用,能够提高肿瘤细胞结构蛋白的翻译合成速度, 影响到癌细胞的扩增风险[10,11]。有研究者探讨了COX-2 蛋白在喉癌患者中的表达情况，发现在喉癌患者病灶组织中，COX-2 蛋白的表达阳性率可超过30%以上[12],但缺乏对于C OX-2 的表达与喉癌术后复发的关系研究。 本次研究通过对喉癌术后复发患者病灶组织中COX-2蛋白的表达分析,能够在部分揭露喉癌复发机制的同时，为临床上喉癌的复发提供高危预测性指标。

本次研究重点探讨了COX-2 蛋白在喉癌患者中的表达情况,发现在复发的喉癌患者病灶组织中，COX-2 蛋白的表达阳性率水平明显上升，高于未复发的喉癌患者，统计学差异显著，表明COX-2蛋白的高表达能够影响到喉癌的术后复发过程。COX-2 蛋白的高表达对于喉癌复发影响的机制，主要在于COX-2 蛋白能够通过影响到残留癌细胞染色体末端结构的稳定性,提高氧化应激环境中癌细胞基因突变的风险,最终促进残留癌细胞的异常增殖和异常分化过程。 有其他研究者也认为，在喉癌患者病灶组织中，COX-2 蛋白的表达阳性率水平可随着患者临床预后的恶化而明显上升，特别是在合并有远期复发或者远处转移的患者中，COX-2 蛋白的高表达态势更为明显[13]。 对于复发及未复发喉癌患者进行临床病理特征的对比，发现在复发组喉癌患者中,其癌细胞分化程度往往较低，同时癌细胞低分化的占比更高，提示了癌细胞分化程度及淋巴结转移对于喉癌术后复发的影响。分析其原因,考虑由于低分化的癌细胞，其生物学行为的恶化较为明显，浸润及转移的风险较高，从而增加了喉癌复发的可能； 而淋巴结转移的患者,其癌细胞播散的风险也往往较高，癌细胞的过度播散影响到了手术根治性切除的效果,导致喉癌术后复发的发生[14,15]。 但本次研究并未发现喉癌临床分期或者喉癌位置对于喉癌复发的影响,提示临床分期的改变并不会影响到残留癌细胞的复发风险。 危险因素分析可见，分化程度越低、发生淋巴结转移、COX-2 阳性表达是喉癌患者术后复发的独立危险因素,提示临床上对于相关高危因素的患者，应采用综合性的治疗措施，进而改善喉癌患者的临床结局。 术后复发的喉癌患者生存期降低的重要原因,但临床并无有效的喉癌术后复发预测指标。 而本组研究通过检测研究发现，术后复发的喉癌患者中，COX-2 蛋白的表达阳性率较高, 同时COX-2 高表达、癌细胞低分化或者淋巴结转移，是影响喉癌复发的独立风险因素，COX-2 等指标或可能成为喉癌术后复发预测指标。

综上所述, 本次研究对于喉癌患者中COX-2蛋白的表达分析,能够为临床上喉癌的治疗提供高危预测性指标。