Sema4D对RSV所致哮喘大鼠Th1/Th2的免疫调节及咳喘宁口服液的干预作用*

伍 晴，罗银河△，王孟清，陈莹莹，马晓萌，胡 燕

（1湖南中医药大学，湖南长沙410208；2湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

支气管哮喘（简称哮喘）的免疫学机制是Th1/Th2 细胞功能失衡，Th2 免疫应答优势，刺激其他细胞产生一系列炎症介质，最终诱发速发型变态反应和慢性气道炎症［1］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起小儿呼吸道黏膜感染的常见病原体，与哮喘的发病存在明显关系。RSV 是单链RNA 病毒，其中所含的F 蛋白主要引起Th1 型炎症反应，G 蛋白主要引起Th2 型炎症反应，因此RSV感染可以导致以上2种炎症反应的失衡，可能是引起哮喘的因素［2］。脑信号蛋白4D（semxpahorin 4D，Sema4D）在慢性病毒持续感染中发挥重要作用，但是否参与RSV所致哮喘大鼠Th1/Th2的免疫调节，尚待研究［3］。

本研究通过RSV 复合卵清蛋白（ovalbumin，OVA）构建哮喘大鼠模型，观察Sema4D 对RSV 所致哮喘大鼠Th1/Th2 的免疫调节及咳喘宁（Kechuan‑ning，KCN）灌胃处理对哮喘大鼠肺组织病理改变和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中相关炎症因子的影响，为阐明咳喘宁通过调节Sema4D 减轻RSV 所致哮喘气道免疫炎症提供实验依据。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雌性Wistar大鼠100只，90～110 g，28～35日龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0006。

1.2 药物与试剂 咳喘宁口服液（主要由炙麻黄、苦杏仁、细茶叶、桃仁、大青叶、生石膏、黄芪、甘草等组成）由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供［（湘）卫药剂（06）05第085号］，每瓶100 mL，含生药70 g。按临床量效关系确定咳喘宁口服液低、中、高剂量分别为0.33、3和10 mL/kg。RSV 和人喉癌上皮Hep-2 细胞（武汉大学病毒研究所）。鸡OVA（Solarbio）；Sema4D 重组蛋白（Sino Biological，生产批号80320-R08H）；抗Sema4D 抗体（Bioss，生产批号bs-6965R）；白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）的ELISA 试剂盒（上海晶天生物科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 大鼠RSV 复合OVA 哮喘模型的制备 将大鼠随机分为正常（normal）组（10 只）和哮喘模型组（90只）。参照文献建立急性哮喘大鼠模型［4-6］，以滴度为1.0×109空斑形成单位（plaque-forming unit，PFU）/L的 RSV 50 µL 鼻腔滴入，第 2 天相同剂量加强 1 次，第 2～7 天正常饲养，从第 7 天开始给予 1%OVA 隔天雾化吸入，每次30 min，持续2 周；正常组在相同时间、相同剂量下予Hep-2 细胞滴鼻吸入及生理盐水雾化。造模结束后选取6 只模型组大鼠进行气道反应性检测，大鼠气道反应性升高并出现喷嚏、鼻腔分泌物增多、呼吸加快等行为学表现提示造模成功。

2.2 动物分组及给药 将造模成功的大鼠按随机数字表法分为9 组，每组6 只，包括：模型（model）组；Sema4D 组（0.01 mg/kg Sema4D 重组蛋白腹腔注射）；Sema4D 抗体组（0.01 mg/kg Sema4D 抗体腹腔注射）；咳喘宁低、中、高剂量组（以低、中、高剂量的咳喘宁口服液灌胃）；Sema4D+咳喘宁低、中、高剂量组（以Sema4D 腹腔注射及低、中、高剂量的咳喘宁口服液灌胃）。正常组和模型组予等量生理盐水灌胃，每日1次，共2周。

2.3 标本采集

2.3.1 BALF 采集 对经方法2.2 治疗2 周后的所有大鼠进行胸腔麻醉后用细线绑好四肢及头部，固定在无菌鼠板上，用手术剪逐层剪开大鼠胸颈部皮肤和筋膜，分离颈部血管，一侧气管结扎，注入0.5 mL PBS 进行支气管肺泡灌洗，反复3 次，收集BALF（回收率＞80%为合格），4℃离心15 min，取上清液于-80℃冰箱保存。

2.3.2 肺脏标本处理 完整分离出大鼠两侧肺脏，一侧于4%多聚甲醛浸泡固定，另一侧于-20℃冷冻保存。

2.4 肺组织学检查 将经4%多聚甲醛溶液固定的肺组织，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、脱蜡和水化，然后进行HE 染色，于光学显微镜下观察各组大鼠肺组织病理学变化。

2.5 BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 含量的检测 根据ELISA 试剂盒说明书的步骤，依次检测 BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 的含量。通过标准曲线计算其浓度。

3 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析。所有数据以均数±标准差（mean±SD）表示。多样本间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠肺组织HE染色结果

HE 染色结果显示，正常组大鼠支气管黏膜上皮无变形，肺泡及血管形态规整，无细胞脱落，无明显炎症细胞渗出、浸润；模型组、Sema4D 组及Sema4D+咳喘宁低剂量组大鼠支气管及血管周围可见明显的炎症细胞浸润，管壁各层可见嗜酸性粒细胞和单核细胞等炎性团块聚集，肺泡形态不规整，含大量杯状细胞，黏膜上皮局部脱落，黏膜下水肿；Sema4D抗体组、咳喘宁低、中、高剂量组及Sema4D+咳喘宁中、高剂量组上述病理变化均较模型组明显减轻，炎症细胞浸润减少，肺泡形态较为规整，见图1。

Figure 1.HE staining of lung tissues of the rats in different groups（scale bar=100 µm）.A：normal group；B：model group；C：Sema4D group；D：Sema4D antibody group；E：low dose of KCN group；F：middle dose of KCN group；G：high dose of KCN group；H：Sema4D+low dose of KCN group；I：Sema4D+middle dose of KCN group；J：Sema4D+high dose of KCN group.图1 各组大鼠肺组织HE染色

2 BALF中各种炎症因子含量的比较

ELISA 结果显示，与正常组相比，其余各组BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的含量都有不同程度的升高，IFN-γ 显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组相比，Sema4D 组 IL-4、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的含量显著升高，IFN-γ 的含量降低（P＜0.05 或P＜0.01），Sema4D 抗体组，咳喘宁低、中、高剂量组，以及Sema4D+咳喘宁中、高剂量组的IL-4、IL-6、IL-8 和TNF-α 含量均显著降低（P＜0.01），IFN-γ 显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），而Sema4D+咳喘宁低剂量组上述指标的差异无统计学意义（P＞0.05）；与咳喘宁低、中、高剂量组相比，Sema4D 抗体组及Sema4D+咳喘宁中、高剂量组上述指标均无显著差异（P＞0.05），见图2。

Figure 2.Comparison of the levels of inflammatory factors in BALF of the rats in different groups.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.图2 各组大鼠BALF中炎症因子含量的比较

讨 论

RSV 感染可引起Th1 和Th2 两大功能亚群的炎症反应，Th1 细胞主要介导细胞免疫，即杀灭病毒和其他胞内病原体，其产生的IFN-γ可以抑制炎症因子IL-4 的水平，IL-4 过高会促进免疫球蛋白E 的生成，诱发机体反复喘息，因此通过IFN-γ抑制IL-4可以避免患儿进一步发展成哮喘［7-8］；Th2 细胞介导变态反应，其产生的IL-4和IL-6促进了IgE 的合成及嗜酸性粒细胞在气道内的聚集、活化和释放细胞因子，可引起哮喘的慢性炎症和气道高反应性，刺激成纤维细胞增生及杯状细胞分化，参与气道重建［9］。RSV感染后，呼吸道单核吞噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等产生的IL-8 和TNF-α，可介导炎症细胞聚集并破坏上皮/内皮结构，参与炎症反应及气道重塑［10］。IL-8 和TNF-α 在RSV 感染诱发哮喘的发病机制中具有重要作用［11-12］。

Sema4D 在免疫炎症发挥关键的调控作用［13］，且Sema4D是Th2驱动型哮喘病理生理过程的重要调节因子，Sema4D缺失可能会抑制肺部Th2 细胞因子的产生［14-15］。本研究结果证实，Sema4D 可使哮喘大鼠BALF中IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α水平升高，IFN-γ含量降低，引起Th1/Th2 失衡，加重哮喘症状；Sema4D抗体组的炎症因子浓度与正常组无显著差异，说明通过干预Sema4D 可以减少炎症因子的产生，纠正Th1/Th2失衡。

咳喘宁口服液以传统古方五虎汤为基本方研制而成，具有发表清热、化痰和平喘的功效，在临床上用以防治病毒感染引起的哮喘，疗效肯定，且与Th亚群调节作用相关［16］。本研究结果表明，咳喘宁对RSV 所致哮喘有效，且Sema4D 联合咳喘宁中、高剂量组BALF 中炎症因子浓度与咳喘宁各剂量组相比无显著差异，说明咳喘宁可能通过干预Sema4D，调节Th1/Th2失衡，减轻免疫炎症，以达到治疗效果。

综上所述，本研究结果表明，咳喘宁可能通过干预Sema4D，调节Th1/Th2 免疫失衡，减少炎症因子产生，从而抑制RSV所致哮喘大鼠的免疫炎症。