IL-33修饰的BMSCs通过MyD88减轻脓毒症所致大鼠急性肾损伤的疗效观察*

隗世波，刘青云 ，石雅娴

（武汉科技大学 1附属汉阳医院重症医学科，2职业危害识别与控制湖北省重点实验室，湖北武汉430050）

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征。全球每年脓毒症患者超过1 900 万例，其中600 万人死亡，而存活的患者大多数存在认知功能障碍［1］。脓毒症与多器官功能衰竭有关，急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是脓毒症患者常见的致死性并发症。据报道，临床上大约50%的AKI 是由脓毒症引起，患者的死亡率达50%～70%［2］。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有免疫调节、促进组织再生修复和抗氧化应激损伤等功能，是近年来研究的热点［3］。既往大量研究证实，移植BMSCs 可以提高脓毒症AKI 大鼠的存活率［4-5］。然而，移植微环境会影响细胞的存活，并且可能限制其向靶器官分化，削弱了BMSCs 移植修复损伤组织和器官的能力，成为干细胞治疗中的一个重点和难点。

白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）是IL-1 家族成员，因为具有抗炎作用而受到广泛关注。IL-33可以促进Th1细胞向Th2细胞转化，从而发挥抑制炎症反应的作用。研究显示，用IL-33基因修饰BMSCs可减少其凋亡，并影响T 细胞增殖和巨噬细胞计划，进而改善心梗后大鼠的心脏功能［6］。有研究表明，IL-33可以通过其受体ST2发挥减轻脓毒症和急性肾损伤的作用［7-9］。髓样分化因子88（myeloid differen‑tiation factor 88，MyD88）是IL-33 的靶分子，在脓毒症AKI 发病中有重要意义［10］。转基因治疗是通过基因修饰，用目的基因转染细胞并回输体内。本研究利用基因工程方法将IL-33转染入BMSCs，然后对脓毒症AKI 大鼠进行干预，检测治疗后肾组织中促炎细胞因子及MyD88的表达情况，旨在观察IL-33修饰的BMSCs治疗脓毒症AKI的效果。

材料和方法

1 实验动物

80 只SPF 级雄性SD 大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2006-2009］，6～8 周龄，体重约（250±20）g。允许大鼠自由摄食和饮食，饲养环境为温度22℃，湿度60%，明暗周期12 h/12 h。将大鼠随机分为对照（control）组、模型（model）组、阴性转染（negative transfection）组（移植未转染的BMSCs）和IL-33转染（IL-33transfec‑tion）组（移植转染IL-33的BMSCs），每组20只。

2 试剂和仪器

大鼠 BMSCs（Thermo Fisher Scientific）；胎牛血清、DMEM 培养基、青霉素和链霉素（武汉华美公司）；PCR 检测试剂盒（Sigma）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天公司）；IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）和MyD88 多克隆抗体（Bioworld）。CKX53 倒置相差显微镜（Olympus）；AU680全自动生化仪（Beckman Coulter）；ImageQuant LAS 4000成像系统（GE Healthcare）。

3 方法

3.1 BMSCs 的培养及鉴定 将100 mL 胎牛血清及10 mL 抗生素（青霉素和链霉素1∶1 混合液）加入1 L DMEM 培养基，混匀后稀释10 倍。吸取BMSCs 悬浮液加入培养液，37℃、5% CO2条件下培养，2 d 换液1次。待细胞融合80%时去除培养液，吸取贴壁细胞，用3%胰蛋白酶消化3 min。随后用含10%胎牛血清的低糖培养液终止消化，制备细胞悬液，接种于细胞培养瓶中，37℃、5% CO2条件下培养，经流式细胞术鉴定细胞表面标志物 CD34、CD45、CD29、CD73 和CD90。传代培养至第3 代的细胞可发出较强的荧光，用荧光显微镜观察传代细胞的形态。

3.2IL-33转染和RT-qPCR 检测 首先用PCR 技术扩增IL-33cDNA（上游引物序列为5'-GGAACAACA‑CAGCAAGCAAAGCCT-3'，下游引物序列为5'-TA‑AGGCCAGAGCGGAGCTTCATAA-3'；由苏州合惠生物科技有限公司设计并提供），随后构建IL-33慢病毒载体，在脂质体介导下与质粒共转染感受态大肠埃希菌 DH5α，用IL-33慢病毒感染第 3 代 BMSCs［11］。用 RT-qPCR 法检测转染后 BMSCs 中 IL-33 mRNA 的表达情况。用Trizol 法提取总RNA，逆转录后进行qPCR 检测。每个样本最少重复3 次，设置3 个复孔。反应条件为：预变性 95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 个循环。IL-33 的上游引物序列为5'-TTGGAGA‑ATGGATGTTACGTG-3'，下游引物序列为5'-ACCAT‑CAGCTTCTTCCCATC-3'；内参照 GAPDH 的上游引物序列为5'-GGCATTGCTCTCAATGACAAC-3'，下游引物序列为5'-TGCTCTCAGTATCCTTGCTG-3'。

3.3 脓毒症大鼠模型的建立及BMSCs 移植 用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法建立脓毒症大鼠模型［12］，操作如下：用2%戊巴比妥腹腔注射（20 mg/kg）进行麻醉，取腹部正中切口，长度约1 cm；逐层打开腹膜，找到盲肠后游离其远端，将盲肠内粪便挤向远端，用3 号丝线结扎盲肠中段并用12 号针头在盲肠远端穿孔2 次，挤压少许粪便于盲肠表面，然后将盲肠回纳，缝合腹膜、关闭腹腔。术后单笼饲养。术后24 h，阴性转染组大鼠经尾静脉注射BMSCs 悬液10 µL［4］；IL-33转染组注射转染成功的BMSCs 悬液10 µL；模型组大鼠尾静脉注射10µL DMEM 培养液；对照组为正常大鼠，不给予任何干预。

3.4 肾功能检测 移植前及移植后24、48 和72 h，从大鼠眼眶静脉采血1.5 mL，用全自动生化检测仪检测血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

3.5 HE 染色观察大鼠肾组织结构 移植72 h 后，取大鼠右肾组织固定于10%中性福尔马林，常规脱水、石蜡包埋，切片厚度为4 µm，进行HE 染色。方法如下：用无水乙醇浸没盖玻片20 min，PBS 漂洗3遍后浸入苏木紫染液；用超离子水洗涤3 遍后将玻片浸入1%盐酸酒精溶液中1 s；再用超离子水浸洗10 min；随后浸入淡氨水中，10 min 后浸入伊红染色液中10 min；超离子水冲洗，用95%乙醇脱水2次，无水乙醇脱水3 次，加入二甲苯，最后用中性树脂封片，显微镜下观察病理表现。采用改良Rabb 法对肾脏损伤进行评价，肾脏损伤包括12 种形态学变化：肾小球皱褶、肾小囊扩张、肾小球上皮细胞坏死等。每种损伤评价标准：无病变，0 分；损伤范围＜5%，1分；损伤范围5%～25%，2 分；损伤范围25%～75%，3分；损伤范围＞75%，4分［13］。

3.6 TUNEL法检测细胞凋亡 移植72 h后，取大鼠肾组织做石蜡切片，用二甲苯清洗2 次，随后用梯度乙醇浸洗1 次。用蛋白酶K（20 mg/L）处理组织20 min，在加入含20%过氧化氢的PBS。待玻片干燥后，加入50µL 的TUNEL 反应混合液，盖上盖玻片在暗湿盒中反应1 h。随后加入反应终止液，37℃下保存 20 min。在组织处加入 50 µL 的 DAB 底物，反应15 min，后经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明和中性树脂封片。用荧光显微镜观察切片，TUNEL 阳性细胞发出绿色荧光。

3.7 Western blot 检测 IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4 和MyD88 的表达 样品中加入SDS 缓冲液煮沸5 min使蛋白变性。经凝胶电泳（SDS-PAGE）后将蛋白转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，孵育I 抗，4℃过夜，弃去I 抗，TBST 洗膜3 次，每次5 min。室温孵育 II 抗 2 h，弃去 II 抗，TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。用 ImageQuant LAS 4000 成像系统显色，以 β-actin 作为内参，计算目标蛋白条带与β-actin灰度比值。

4 统计学处理

采用SPSS 20.0进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（mean±SD）表示，组间均数比较采用重复测量方差分析或单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验；生存率比较用Kaplan-Meier法，两两比较用log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 BMSCs的形态学特征及鉴定

传代后BMSCs 生长迅速，4 d 后基本长满瓶底，呈梭形，第1、2、3 代细胞增殖活跃，大部分细胞单层贴壁生长。当细胞融合85%时，细胞均匀分布，细胞核和核仁清楚可见，呈漩涡状分布，第3 代BMSCs 增殖速度明显加快，生长旺盛，见图1。流式细胞术检测第3代BMSCs表面标志物，其中，CD34和CD45阳性表达率分别为 0.7% 和 0.5%，CD29、CD73 和CD90 阳 性 率 分 别 为 98.4%、98.9% 和 99.1%，见图2。

2 转染后BMSCs 中IL-33 mRNA 表达及BMSCs在大鼠体内的定植情况

Figure 1.Morphological characteristics of the 3rd generation of BMSCs.A：BMSCs under an inverted microscope be‑fore transfection；B：BMSCs under a fluorescence mi‑croscope after transfection.Scale bar=200µm.图1 BMSCs的形态学特征

转染后BMSCs 中IL-33 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05），见图3A，说明转染IL-33成功，BMSCs中IL-33 呈高表达。模型组大鼠外周血和肾组织中IL-33 mRNA 表达水平显著高于对照组，IL-33转染组IL-33 mRNA 表达水平显著高于模型组、对照组及阴性转染组（P＜0.05），见图3B、C，说明尾静脉注入转染IL-33基因的BMSCs 后，血液和肾脏中IL-33 的表达水平显著升高。

3 各组大鼠一般情况

CLP后24 h，模型组大鼠出现躁动、寒战、疲乏和竖毛现象。模型组大鼠处死后，肉眼可见腹腔内有血性渗出液，盲肠变黑且粘连，肠管胀气，部分大鼠有肠间和（或）肾周积脓。模型组大鼠的生存率显著低于对照组（P＜0.05）；IL-33转染组大鼠的生存率高于模型组和阴性转染组（P＜0.05），见表1。

Figure 2.Identification of the BMSCs by flow cytometry.图2 流式细胞术鉴定BMSCs

Figure 3.The mRNA expression levels of IL-33 in BMSCs after transfection（A）and in peripheral blood（B）and kidney tissues（C）of the rats after transplantation.Mean±SD. n=20.*P＜0.05 vs untransfected group；#P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 model group.图3 转染后BMSCs中及移植后大鼠外周血和肾组织中IL-33的mRNA表达水平

表1 移植后各组大鼠的存活情况Table 1.Survival of the rats in each group after transplantation［n（%）］

4 各组大鼠SCr和BUN比较

模型组和阴性对照组大鼠SCr 和BUN 水平均高于对照组（P＜0.05）；IL-33转染组大鼠SCr 和BUN 水平均显著低于模型组和阴性转染组（P＜0.05），见表2、3。

表2 移植后各组大鼠SCr水平比较Table 2.Comparison of serum creatinine（SCr）levels in rats after transplantation（mg/dL.Mean±SD. n=20）

表3 移植后各组大鼠BUN水平比较Table 3.Comparison of blood urea nitrogen（BUN）levels in rats after transplantation（mg/dL.Mean±SD. n=20）

5 各组大鼠肾组织形态学特征

模型组和阴性转染组大鼠可见明显的肾小管损伤，包括上皮肿胀、刷状边界损失和严重管腔扩张，肾间质可见炎症细胞浸润，肾小球有瘀血；模型组和阴性对照组大鼠肾脏组织病理损伤评分均显著高于对照组（P＜0.05），IL-33转染组大鼠肾脏组织病理损伤评分显著低于模型组和阴性转染组（P＜0.05），见图4。

6 各组大鼠肾组织细胞凋亡情况

模型组和阴性转染组肾组织凋亡细胞比例显著高于对照组（P＜0.05）；与模型组和阴性转染组比较，IL-33转染组肾脏组织凋亡细胞比例明显降低（P＜0.05），见图5。

7 各组大鼠肾组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4 和MyD88蛋白表达水平

模型组和阴性转染组大鼠肾组织IL-1β、IL-6、TNF-α 和MyD88 蛋白表达水平显著高于对照组（P＜0.05）；与模型组和阴性转染组比较，IL-33转染组IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4 及 MyD88 蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），见图6。

讨 论

IL-33 属于IL-1 家族成员，能够促进T 淋巴细胞亚群介导的自身特异性变态反应，促进IL-4、IL-5 和IL-13 的分泌，增强 Th2 型免疫［11-13］；同时，还可以促进自然杀伤细胞和自然杀伤T 细胞分泌IFN-γ，激活Th1 型免疫，在Th1/Th2 的免疫调节中发挥了重要作用［14-16］。有研究显示，在脓毒症动物模型中，IL-33可促进中性粒细胞向感染部位趋化，并促进IFN-γ的分泌，进而提高脓毒症小鼠的存活率［17］。Cao 等［8］观察到IL-33 可以预防缺血再灌注小鼠的肾结构和功能损伤。但目前尚未见关于IL-33 治疗脓毒症AKI的效果及机制研究的报道。

Figure 4.The histomorphological changes of rat kidney tissues 72 h after transplantation（HE staining，scale bar=100µm）and com‑parison of renal pathological injury scores.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs negative transfection group.图4 移植72 h后HE染色观察大鼠肾组织形态学变化和肾脏病理损伤评分比较

Figure 5.The apoptosis in rat kidney tissues was detected by TUNEL assay 72 h after transplantation（scale bar=100 µm）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs negative transfection group.图5 移植72 h后TUNEL法检测大鼠肾组织细胞凋亡情况

本研究用IL-33基因对BMSCs 进行修饰，转染后大鼠存活率显著提高，并且肾功能指标显著改善。采用HE染色观察大鼠肾组织病理学变化，结果显示IL-33修饰的BMSCs 可以明显改善肾脏病理损伤，同时可显著降低脓毒症AKI 大鼠肾脏组织细胞凋亡比例，提示IL-33修饰的BMSCs 可显著减轻脓毒症AKI大鼠的肾脏损伤，减少肾组织细胞凋亡，提高大鼠存活率。

Figure 6.The expression levels of IL-1β，IL-6，TNF-α，TLR4 and MyD88 in kidney tissues of rats in each group 72 h after transplan‑tation.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs negative transfection group.图6 移植72 h后各组大鼠肾组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4和MyD88蛋白表达水平

研究显示，TLR4/MyD8 信号转导通路在脓毒症的发病中发挥重要作用［18］。郭皓等［19］的研究显示，TLR4 介导的炎症反应参与了脓毒症AKI 的发生过程。TLR4 可释放 IL-1β、IL-6、TNF-α 等多种炎症因子，不仅可直接损害肾脏实质细胞，还可激活依赖TLR4 的免疫细胞，诱导细胞因子，发挥肾损伤作用。研究显示，使用TLR 拮抗剂可明显减轻脓毒症引起的 AKI［20］。还有研究显示，IL-33 可以通过下调MyD88 促进 Th2 细胞分泌 IL-4 和 IL-13，进而发挥抗炎作用［21］。MyD88 的激活可以促进 IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表达，进而引起细胞和组织发生炎症性损伤［22-23］。因此 ，本研究推测 IL-33 可能通过调控TLR4/MyD88 信号转导通路介导的炎症反应发挥作用。MyD88 是IL-33 下游的靶分子，与细胞增殖、分化和凋亡密切相关［24］。MyD88 与脓毒症 AKI 的病理损伤密切相关［25］。本研究结果显示，IL-33修饰的BMSCs 治疗后 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 表达水平均显著下降，说明IL-33可能通过MyD88减轻肾组织炎性损伤，进而治疗AKI。同时，与模型组和阴性转染组比较，IL-33转染组TLR4 及MyD88 蛋白表达水平显著下降，提示IL-33基因修饰的BMSCs 可能通过抑制TLR4/MyD88 的激活，减轻AKI 肾组织炎性损伤，改善肾功能。

综上所述，IL-33基因修饰的BMSCs对脓毒症大鼠AKI 的疗效显著，治疗后大鼠肾脏病理损伤明显减轻，细胞凋亡明显减少，其机制可能与IL-33 调控TLR4/MyD88信号通路、抑制肾脏炎症反应有关。未来需要进一步进行机制研究，以明确IL-33 对BMSCs的作用及对AKI肾脏的保护作用。