我国不同地区猪源致泻性大肠杆菌的多重PCR 鉴定及2b-RAD 序列分析

（中国动物卫生与流行病学中心，农业农村部畜禽产品质量安全风险评估实验室（青岛），山东青岛 266032）

大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是肠杆菌科（Enterobactericaeae）中寄生于恒温动物消化道下段、兼性厌氧的革兰氏阴性杆状细菌，但在特定情况下可致病：一类是细菌寄生部位发生改变，成为机会致病菌；另一类是致泻性大肠杆菌，可引起婴幼儿与成年人细菌性腹泻、呕吐、发热等。根据毒力因子和发病机制不同，可将致泻性大肠杆菌分为5 类：产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC），肠致泻性大肠杆菌（EnteropathogenicE.coli，EPEC），肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC），肠侵袭性大肠杆菌（EnteroinvasiveE.coli，EIEC）和肠聚集性大肠杆菌（EnteroaggregativeE.coli，EAEC）[1]。

在过去的40年内，较为严重的致泻性大肠杆菌感染事件均是通过食物传播引起的。例如，美国多次暴发的与肉馅有关的O157:H7食物中毒事件，日本1996年暴发的与进食牛肉有关的大肠杆菌疫情，2020年我国贵州省一所学校发生的200 多名学生大肠杆菌食物中毒事件。可见，致泻性大肠杆菌在食源性疾病中扮演着重要角色，目前已成为各国畜禽产品致病微生物监测和控制的重点。猪肉是我国广大居民最主要的动物源性食品，而生猪屠宰环节是肉品受致病菌污染的关键风险点之一。因此，及时监控生猪屠宰环节中致泻性大肠杆菌污染情况，对控制其传播、降低食品安全隐患具有重要意义[2]。

为了解我国不同地区生猪肉品中致泻性大肠杆菌的污染情况及系统进化关系，本研究对近几年分离自华北、华东、华中及西南4 个地区生猪屠宰环节的283 株大肠杆菌进行了致泻特性鉴定，并通过2b-RAD 测序，对阳性致泻菌进行分型分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 近几年分离自华北、华东、华中及西南4 个地区猪屠体表面拭子的283 株大肠杆菌，其中华北地区60 株、华东地区123 株、华中地区74 株、西南地区26 株，以上菌株均由中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室分离、鉴定和保存。5 种致泻性大肠杆菌标准菌株，由中国疾病预防控制中心馈赠。

1.1.2 主要仪器与试剂 冷冻离心机：购自艾本德（上海）国际贸易有限公司；水浴锅：购自天津泰斯特仪器有限公司；PCR 扩增仪：购自杭州博日科技有限公司；电泳仪：购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；凝胶成像分析系统：购自上海天能科技有限公司。2×TaqMaster Mix：购自南京诺唯赞生物科技有限公司；琼脂糖：购自西班牙Biowest 公司；DL2000 DNA Marker：购自宝生物工程（大连）有限公司；胰蛋白胨大豆肉汤：购自北京陆桥技术股份有限公司；5 种致泻性大肠杆菌多重PCR 鉴定试剂盒：来自中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室（生产批次20190917，有效期1年）。

1.2 方法

1.2.1 致泻性大肠杆菌多重PCR 鉴定 本次检测的5 种致泻类型和相应的毒力基因分别为：ETEC-est/elt、EPEC-eae、EHEC-eae+stx、EAECaggR、EIEC-ipaH。采用煮沸法提取283 株待检菌株的DNA 模板，PCR 反应体系为：2×TaqMaster Mix 12.5 µL、混合引物1 µL、DNA 模板1 µL、去离子水10.5 µL。引物序列及混合方法参见文献[3]。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72℃延伸10 min。配制2.5%浓度的琼脂糖凝胶，取10 µL PCR 产物于加样孔中，120 V 电泳30 min，在凝胶成像分析仪中观察电泳结果。

1.2.2 2b-RAD 测序 挑取致泻性大肠杆菌单菌落接种至2 mL 胰蛋白胨大豆肉汤中，置于37 ℃温箱中培养18 h；每株阳性菌各吸取200 µL 送至青岛欧易生物科技有限公司进行2b-RAD 测序。

1.2.3 序列分析 利用软件Structure（Verison 2.3.4），对所有测序个体进行种群结构聚类分析；利用软件Treebest（Version 1.9.2），将获得的序列构建NJ（Neighbor-Joining）树，树的可靠性通过bootstrap 法进行检验（重复1 000 次）。

2 结果与分析

2.1 致泻性大肠杆菌鉴定

5 种致泻类型和6 种毒力基因的PCR 阳性结果见图1。本试验共从283 株大肠杆菌中鉴定出36株致泻性大肠杆菌，阳性检出率为12.72%。其中，西南地区最高，为26.92%（7/26），华东地区最低，为10.57%（13/123）。这36 株致泻性大肠杆菌中，ETEC、EPEC、EAEC 占比较高，分别为33.33%、30.56%、25.00%；而EHEC、EIEC 占比较小，均为5.56%。具体结果见表1。

2.2 种群结构分析

利用软件Structure（Verison 2.3.4），对所有测序个体进行种群结构聚类。为挑选合适的N（软件内部称之为K值），依次设置不同的N值进行多次计算[4]。这里，N值依次选用了3～10 之间的整数，每个N值做3 次重复。根据变化曲线，最终选择N=8 时的结果作为种群分析结果。分群结果（图2）显示，研究群体推断由8 个亚群组成，即这36 株致泻性大肠杆菌可分为8 个亚群。

2.3 系统发生进化树分析

图1 5 种致泻类型和6 种毒力基因的PCR 结果

表1 不同地区致泻性大肠杆菌检出情况

图2 36 株致泻性大肠杆菌的种群结构聚类图

图3 36 株致泻性大肠杆菌的系统发生进化树

将获得的序列利用软件Treebest（Version 1.9.2），构建NJ（Neighbor-Joining）树，并对树的可靠性通过bootstrap 法进行检验（重复1 000 次）[5]。结果（图3）显示：第一，亲缘关系较近菌株的致泻类型基本一致，如1、3、5 均为EAEC，13、14均为ETEC，219、280 均为EPEC；第二，亲缘关系较近菌株的分离时间大都比较接近，如1、3、5均分离自2008年，80、141、143、196、207 分离自2010—2012年；第三，来自同一地区菌株的亲缘关系相对较近，如49、50、51、52 均来自华北地区，141、143、196、207 均来自西南地区。通过与图2 比较发现，以上结果与种群聚类结果基本一致。

3 讨论

大肠杆菌广泛存在于自然界和动物肠道。本实验室近年来评估发现，生猪屠宰环节的大肠杆菌污染，特别是致泻性大肠杆菌污染，是危害肉品安全的主要风险之一。通过致泻性大肠杆菌的多重PCR 鉴定及2b-RAD 序列分析，可以更加了解我国不同地区生猪肉品中致泻性大肠杆菌的污染情况及彼此间的亲缘关系，为精准防控生猪屠宰环节致泻性大肠杆菌污染，保障肉品卫生安全提供了科学数据和技术支撑。

目前，用于鉴定致泻性大肠杆菌的检测方法有多种，如动物试验、血清型鉴定、毒力基因测定等。其中：动物试验耗时长，如动物选择不合适或菌株毒力不够强等，均可导致试验结果不可信；血清型鉴定费用高、敏感性低，且血清来源和质量以及菌体表面的其他抗原也会影响检测的准确度[6]；基于不同毒力基因的PCR检测方法具有简单高效、准确特异等优点，但单基因PCR 一次只能检测一种毒力基因或病原，当需要检测多种基因时就费时费力，成本增加。本试验采用的多重PCR 检测方法可高通量测定6 个毒力基因，一次性区别5 种致泻性大肠杆菌，大大节约了试验时间和成本，且本方法与单基因PCR 鉴定和血清型鉴定的符合率均为100%[3，7]。

本研究从283 株大肠杆菌中共鉴定出36 株致泻性大肠杆菌，检出率为12.72%，其中西南地区检出率（26.92%）高于其他几个地区，与张敏等[8]得出的四川省致泻性大肠杆菌检出率（29.6%）相似。这可能与当地生猪屠宰场硬件设施配备不足、卫生控制措施执行不严、冷链设施覆盖率不高、微生物相关检测开展不普遍有关。对于致泻性大肠杆菌检出率较高的地区，应当特别注意其预防和控制，以有效保障肉品卫生安全。本研究发现，在5 种致泻类型中，ETEC、EPEC、EAEC 占比较高，表明我国屠宰生猪肉品中污染的致泻性大肠杆菌以这3种类型为主。

针对病原建立高效准确的追溯技术和分型方法，对于预防和控制病原菌引起相关疾病具有重要的意义。目前常用的大肠杆菌分型方法有表型分型和分子分型两大类。表型分型成本低、操作简单，不需要大型仪器设备[9]，因此在基层应用比较广泛[10]。但其结果容易受培养条件及菌体状况影响，还需其他方法补充验证[11]。分子分型方法比较常用的有脉冲场凝胶电泳分型技术（PFGE）、多位点序列分析（MLST）等，但PFGE 在色谱图上只能反映片段的尺寸和数目，两个序列不同的片段可能分子量相似，因此可能出现假阳性。此外，如果试验中使用不同的限制性内切酶，得到的电泳图谱也会有一定的差异[12]。而MLST 方法运用了高通量测序技术和生物信息学，重复性好、分辨率较高，但不适用于管家基因无变异或变异较低的菌株。2b-RAD 是一种新型的分子分型技术，它利用IIB 型限制性内切酶，通过基因组酶切产生等长的33～36 bp 的酶切标签。这些标签经过富集后用于下游的高通量测序反应，通过生物信息学分析实现全基因组范围高通量SNP 筛查和分型分析[13-14]，保证了每个标记的可靠性和准确性。

本研究检出的阳性致泻菌株经2b-RAD 测序、种群结构聚类分析，发现36株菌株可分为8个亚群，同一亚群的菌株亲缘关系较近。经系统进化树分析发现：第一，亲缘关系较近菌株的致泻类型基本一致；第二，亲缘关系较近菌株分离时间大都比较接近；第三，来自同一地区菌株的亲缘关系相对较近。由此可见，系统进化树分析结果与种群聚类结果基本一致。但也有例外，这是因为大肠杆菌毒力基因众多，在漫长的细菌进化过程中，质粒等可移动元件会发生水平转移[15-16]，其毒力基因也可以重组，使得致泻类型发生改变。综上，生猪屠宰环节致泻性大肠杆菌的流行分布有一定的地域差异，且其亲缘关系呈一定的时空特异性。