二代测序技术检测新疆地区NSCLC患者基因类型及临床意义

顾国民 朱晓丹 朱红革 刘春玲

摘要：目的  探討新疆地区的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的驱动基因类型，同时通过案例分析和评估二代测序应用在靶向治疗的价值，为临床工作提供理论依据。方法  选取2015 年9 月～2017 年8月在新疆医科大学附属肿瘤医院肺内科二病区诊治的NSCLC患者43例，使用二代测序技术选取与肺癌密切相关的40个基因的全部外显子区域的40基因panel，对纳入本研究的患者的外周血样本进行高通量测序。结果  对本研究3例NSCLC患者外周血样本通过高通量测序发现突变位点为52个，其中有9例患者存在双突变或多个突变位点。EGFR的突变率为40%;EGFR 19 DEL为23.2%;EGFR L858R突变率为7%;EGFR T790M突变率为11.6%;EGFR的少见突变率为7%，18例患者中存在5例双突变。ALK融合突变率为2%，ROS1融合突变率为2%，HER突变率为4%，DNMT3A的突变率为4%，其余基因突变率为2%。对患者的外周血样本进行NGS测序，本研究中筛选出3例NGS检测阳性后服用靶向药物的患者，服用相应靶向药物后，肿瘤病灶均有明显缩小，患者身体状态均有改善。结论新疆地区的非小细胞肺癌患者的基因分型和东亚基因分型类似，二代测序液体活检有助于指导临床靶向治疗提供参考。

关键词：非小细胞肺癌;基因分型; EGFR;ALK;ROS1

中图分类号：R743.2                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.15.026

文章编号：1006-1959（2020）15-0085-04

Abstract：Objective  To discuss the driver gene types of non-small cell lung cancer （NSCLC） patients in Xinjiang， and at the same time analyze and evaluate the value of next-generation sequencing in targeted therapy through case analysis and provide theoretical basis for clinical work.Methods  A total of 43 patients with NSCLC who were diagnosed and treated in the second ward of the Department of Pulmonary Medicine，the Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University from September 2015 to August 2017， were selected using next-generation sequencing technology to select all exon regions of 40 genes closely related to lung cancer the 40-gene panel for high-throughput sequencing of the peripheral blood samples of patients included in this study.Results  High-throughput sequencing of the peripheral blood samples of 3 NSCLC patients in this study found 52 mutation sites， of which 9 patients had double mutations or multiple mutation sites. The mutation rate of EGFR was 40%; the mutation rate of EGFR 19 DEL was 23.2%; the mutation rate of EGFR L858R was 7%; the mutation rate of EGFR T790M was 11.6%; the rare mutation rate of EGFR was 7%. There were 5 double mutations in 18 patients. The ALK fusion mutation rate was 2%， the ROS1 fusion mutation rate was 2%， the HER mutation rate was 4%， the mutation rate of DNMT3A was 4%， and the mutation rate of other genes was 2%. NGS sequencing was performed on the peripheral blood samples of the patients. In this study， 3 patients who took targeted drugs after NGS testing were screened out. After taking the corresponding targeted drugs， the tumor lesions were significantly reduced and the patient's physical condition was improved.Conclusion  The genotyping of patients with non-small cell lung cancer in Xinjiang is similar to that of East Asia. The next-generation sequencing liquid biopsy can help guide clinical targeted therapy and provide a reference.

Key words：Non-small cell lung cancer;Genotyping;EGFR;ALK;ROS1

肺癌（lung cancer）是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率一直居全球各类肿瘤的首位，大约每年有1800万患者诊断为肺癌，每年约有1600万肺癌患者死亡[1，2]。因为分期和地区差异，肺癌5年生存率为4%～17%。其中非小细胞肺癌占全部肺癌的80%～90%，且近年来随着环境污染的日益加重，肺癌的患病人数持续增加[1，3]。肺癌的恶性程度较高，且容易复发和转移，严重影响患者的治疗和预后，因此，选择合理有效的治疗方式对于提高患者的生活质量，延长其生存期并进一步降低死亡率具有重要的意义[2]。目前，临床上治疗肺癌的方式主要有外科手术、化疗、放疗、中医治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等，手术治疗是最为常用也是最有效的治疗方式，可有效切除癌变组织，防止其转移和复发，治疗效果较好，但大多数患者初诊时已为局部晚期或晚期，失去了手术的机會[3-7]。分子靶向药物治疗具有安全性好、耐用性强等特点，且可以直接作用于癌变组织，现已成为治疗恶性肿瘤的重要手段[8-12]。本研究通过新一代测序技术（next-generation sequencing technology）对新疆地区的非小细胞肺癌患者的外周血中的ctDNA基因检测，为了进一步探讨新疆地区的非小细胞肺癌患者的基因分型，同时通过案例分析和评估二代测序在靶向治疗的治疗效果为临床提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料  本研究经过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理文员会审批，选取2015年9月～2017年8月在新疆医科大学第三附属肿瘤医院肺内科二病区诊治的NSCLC患者43例为研究对象，患者知情同意并签署同意书。其中男性27例，女性16例;年龄41～75岁，平均年龄（56.96±12.43）岁;纳入标准：  ①患者临床资料保存完整;②患者均有外周血样本;③抽取外周血样本前两周内未接收化疗药物治疗 和未发生有炎症的患者;④患者的NSCLC分期均为Ⅲb～Ⅳ期。

1.2标本采集  对纳入本研究的患者于诊断明确后或疾病进展后低脂饮食状态下进行血液标本采集，抽取10ml 外周血，使用专门为保存循环肿瘤DNA（ctDNA）BCT管，血液收集在BCT管后立即上下颠倒混匀10次，常温15 ℃～37 ℃运输。

1.3检测方法  采用二代测序，使用诺禾致源的与肿瘤密切相关的40个基因的全部外显子区域的40基因panel对纳入本研究的患者的外周血样本进行高通量测序。

1.4评判标准  肺腺癌TNM 分期以AJCC 第七版分期系统为标准[5];治疗疗效采用实体瘤疗效评价标准RECIST标准1.1 版[6]，疗效分为完全缓解、部分缓解、疾病稳定和疾病进展。总缓解率=（完全缓解+部分缓解）/总例数×100%。

1.5统计学方法  采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料采用（x±s）进行描述，组间比较使用t 检验;计数资料采用（%）进行描述，组间比较使用？字2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1患者的一般病理特征  不同性别、年龄、吸烟史、PS评分、EGFR突变状态比较，差异无统计学意义（P>0.05）;其中腺癌患者占多数，鳞癌患者占26%，大细胞癌占4.3%。不同病理类型及不同期别比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2新疆地区非小细胞肺癌患者基因类型  本研究中43例NSCLC患者外周血样本高通量测序发现突变位点为52个，其中有9例患者存在双突变或多个突变位点。EGFR的突变率为40%;EGFR 19 indel为23.2%;EGFR L858R突变率为7%;EGFR T790M突变率为11.6%;EGFR的稀有突变率为7%，18例患者存在5例双突变。ALK融合突变率为2%，ROS1融合突变率为2%，HER突变率为4%，DNMT3A的突变率为4%，其余基因突变率为2%，见图1。

2.3案例分析  对患者的外周血样本进行NGS测序筛选出3例NGS检测阳性后服用靶向药物的患者，服用相应靶向药物后，肿瘤病灶均有明显缩小，患者身体状态均有改善。

2.3.1 EGFR-TKI耐药后T790M阳性服用奥西替尼1例  患者XX，女性，59岁，汉族，2016年11月确诊为“左肺上叶腺癌cTxN3M1 Ⅳ期（EGFR L858R M+），左锁骨上淋巴结转移，脑、骨转移”，于2016年11月18日行全脑放疗，40 Gy/20F，并行盐酸埃克替尼 125 mg tid po，靶向治疗，疗效PR。2017年5月17日复查PD。血标本进行二代基因检测示T790M+（突变丰度17.332%），自5月31日起予以奥西替尼80 mg 口服，1次/d，D1-30靶向治疗，期间患者仍间断抽搐，予以抗癫痫等对症处理，两月后复查疗效SD，见图2。定期复查至2018年4月疾病进展，姑息治疗后于2018年7月12日死亡。

2.3.2 ALK基因融合阳性服用ALK-TKI 1例  患者XX，男性 57岁，汉族，2016年9月确诊为“右肺上叶腺癌 cT3N2M1 双肺转移 基因状态不明”，给予“培美曲塞+顺铂”方案化疗两周期，复查疾病进展，发现脑及脑膜转移，恶心、呕吐、头晕、头痛症状反复出现并快速加重。行NGS检测结果示ALK基因融合，于2016年11月19日给予克唑替尼进行靶向治疗，服药半月后患者头晕、头痛及恶心、呕吐症状明显减轻，一般情况得到明显改善。患者于2017年1月7日入院复查CT及核磁示肺原发病灶及肾上腺、颅内转移灶均较前好转，且患者脑转移及脑膜转移症状基本完全缓解，疗效评价为PR。继续服用分子克唑替尼进行靶向治疗。患者于2017年2月20日逐渐出现头晕、恶心，症状逐渐加重，并出现头痛、纳差、消瘦、乏力等症状，就诊我院复查，肺部病灶稳定，脑转移进展，后症状进行加重并反复出现抽搐及嗜睡。于2017年3月初患者自服劳拉替尼进行靶向治疗，服药后1月复查疗效评价为PR，症状逐渐好转，服药后有双下肢浮肿，一般   情况明显恢复，2018年8月复查疾病仍为SD，   见图3。

2.3.3 ROS1基因融合阳性服用克唑替尼1例  患者XX，51岁，男性， 因“咳嗽”就诊行CT见右肺上叶占位，并行“右肺上叶肿物切除术”，术后诊断右肺腺癌肺内转移、胸膜转移（T4N0M1 Ⅳ期）， 2016年10月13日复查病情进展，患者提供的病理切片用ARMS PCR 对EGFR、ALK基因的检测，结果示均无突变。后推荐NGS检测，NGS显示ROS基因融合，2016年11月5日自行开始口服克唑替尼 200 mg  2次/d靶向治疗，服药后患者咳嗽气短症状明显改善，2016年12月7日来院复查疗效SDa，2017年2月23日、4月26日复查SD，见图4。2018年4月复查疾病进展，2018年7月21日死亡。

3讨论

我国肺癌发病率为48.32/10万，死亡率为39.27/10万，发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首   位[3-6]。近年来晚期NSCLC 的治疗快速发展，靶向治疗已成为部分肺癌患者治疗的重要方式。EGFR基因是目前研究最为成熟的肺癌驱动基因，EGFR基因突变率在不同种族的人群中存在差异，该基因突变在亚洲人群中最常见。文献报道[2]，亚洲人口EGFR基因突变率达40%，而高加索人群则不足10%。新疆维吾尔自治区位于中国西北边陲，地处亚欧大陆腹地，周边与俄罗斯、哈萨克斯坦、蒙古、印度、阿富汗等8个国家接壤，是个多民族聚居地区，其中维吾尔族和汉族是两大主要民族。有研究报道，当前我国新疆地区的维吾尔族是汉唐时期的回鹘人以及汉族人等人种互相融合的结果，因此，在本研究中通过新一代测序技术对新疆地区的非小细胞肺癌患者的外周血中的ctDNA基因检测，为了进一步探讨新疆地区的非小细胞肺癌患者的基因分型，本研究中的43例NSCLC患者外周血样本通过高通量测序，发现突变位点为52个，其中有9例患者存在双突变或多个突变位点。EGFR的突变率为40%;ALK融合突变率为2%，ROS1融合突变率为2%，HER突变率为4%，这与东亚人群的基因分型基本一致，由于本研究样本较少，可能需要扩大样本群体，进一步研究才能提供更可靠的基因突变比例[4，7，10，15]。

甲醛固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）组织样本是目前临床肿瘤最常见的样本类型[9，10]。但FFPE样本应用于肿瘤个体化治疗的分子病理检测仍有亟待解决的临床问题，如样本珍贵，难以再次获得;核酸高度片段化;DNA、RNA和蛋白质产量低等问题。除组织样本以外，目前血液样本也被逐渐认可，可以作为组织不可取时的首选补充样本。肿瘤是多基因疾病，若使用单基因检测平台进行多基因数据收集，则不可避免要面临样本量不足以完成所需检测项目、检测周期长、费用昂贵等问题，不利实现个体化治疗[11-14]。近年二代基因测序技术快速发展，其应用已进展至临床检测[14，15]。NGS相比于对标获批的AMRS、FISH还是传统方法Sanger测序或灵敏度更高的数字PCR平台均有较高的灵敏度和特异性，同時还能实现多基因的突变检出，在节约样本和时间的同时，有效降低了检测费用，为患者治疗效果的提升提供极大帮助，另外对于新发现的稀有基因变异，也可以供临床医生做一定的科学研究，提高医院科室的学术水平[8，11，14，15]。本研究对患者的外周血样本进行NGS测序，筛选出3例NGS检测阳性后服用靶向药物的患者，服用相应靶向药物后，肿瘤病灶均有明显缩小，患者身体状态均有改善。因此，二代测序液体活检可以为指导临床靶向药物用药的提供参考。

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收稿日期：2020-06-02;修回日期：2020-06-28

編辑/肖婷婷