肠道与肺中ILC2 细胞不同免疫反应特性研究*

郭秉楠 （ 徐州医科大学卫生应急研究所； 徐州医科大学附属医院急救中心，江苏004）

固有淋巴细胞（innate lymphoid cell，ILC）作为一种组织驻留细胞（tissue-resident cell），主要分布在肠、肺和皮肤等组织器官中，发挥维持组织稳态，组织修复，抗击各种病原体、过敏原及肿瘤等作用，在感染性疾病、自身免疫性疾病、炎症及肿瘤等疾病中具有重要意义[1-2]。根据表达转录因子及分泌细胞因子不同，ILCs 通常分为 ILC1，ILC2 和 ILC3[1]。其中ILC2 主要分泌 Th2 型细胞因子如 IL-4、IL-5、IL-9及IL-13 等以及高表达GATA3 转录因子[3]。不同于T 细胞，ILC2 无需特异性抗原激活，IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴生成素（TSLP）以及二十烷酸类物质均可激活ILC2[4-6]。然而，不同组织器官中的ILC2 是否存在功能差异，以及对不同激活剂的反应性目前尚不清楚。本研究通过比较肠道和肺中ILC2 的表达差异，旨在更好理解不同组织中ILC2 的功能和特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57BL/6 小鼠，6～8 周，雌性，20～25 g（南京大学模式动物中心），饲养于SPF 级实验动物中心。各种细胞因子（R&D 公司），GSI（Calbiochem公司），RPMI 1640 培养基、胎牛血清、0.25%胰酶（Gibco 公司），细胞增殖用 EdU（Thermo Fisher 公司），RNeasy 试剂盒（QIAGEN），Reverse Transcrip tase superscript II 试剂盒（Invitrogen），Sybr green real-time PCR 试剂盒（宝生物公司），EdU 检测试剂盒（Thermo 公司）。培养用细胞因子 IL-2、IL-7 和 IL-25（Peprotec 公司），anti-B220（RA3-6B2）、anti-NK1.1（PK136）、anti-CD11b（M1/70）、anti-CD3（2C11）、anti-CD5（53-7.3）、anti-CD45.2（104）、anti-Thy1.2（53-2.1）、anti-CD25（PC61.5）、anti-T1/ST2（DJ8）和 anti-TCRβ（H57）（BioLegend 公司 或 Thermo 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 流式细胞仪分选细胞：取1×108个肠或肺细胞放置于流式管中，用500 μL 流式缓冲液（含0.5%FBS 的 PBS）洗 2 遍，以 300 μL 流式缓冲液重悬细胞，加入相应抗体，轻轻混匀后4 ℃避光孵育30 min，500 μL 流式缓冲液洗 2 遍，上 FACSAria III 流式细胞仪进行细胞分选。以下标记细胞被认为是ILC2 细胞：B220（-）、NK1.1（-）、CD11b（-）、CD45.2（+）、CD3（+）和 T1/ST2（+）；在有些实验中 B220（-）、NK1.1（-）、CD11b（-）、CD45.2（+）、Thy1.2（+）或TCRβ（+）和 CD25（+）。

1.2.2 real-time PCR 检测细胞因子：取分选后的ILC2 细胞用RNeasy 试剂盒提取RNA，采用Reverse transcriptase superscript II 试剂盒合成cDNA，利用引物及Sybr green real-time PCR 试剂盒在LC480 real-time PCR 仪上进行细胞因子检测，以GAPDH为内参。引物由上海金斯特公司合成，序列见表1。

表1 实验所用引物序列

1.2.3 EdU 检测细胞增殖：取分选后的ILC2 细胞1×104个放入 96 孔板，以 10 μmol/L EdU 孵育 2 h，加入10 ng/mL 不同细胞因子孵育7 d。去除培养基，用PBS 洗 2 遍，每孔加入 100 μL Click-iTR fixative，避光室温放置15 min。去除溶液，PBS 洗3 次，每孔加入100 μL Click-iTR固定液，室温放置15 min。每孔加入 0.5 mL Click-iTRPlus reaction cocktail，避光室温放置30 min。Click-iTR固定液洗3 次后，500 μL Click-iTR固定液重悬细胞，上流式细胞仪分析细胞增殖情况。

1.2.4 GSI 抑制 Notch 信号对 IL-25 介导 ILC2 增殖：C57BL/6 小鼠腹腔注射 IL-25（500 ng/只），连续4 天。配置1 mg/mL GSI 溶液于DMSO，每日注射IL-25 前 4 h 以 0.2 mg/只 GSI 溶液注射于 C57BL/6小鼠腹腔。4 d 后处死小鼠，取肺和肠ILC2 细胞进行后续实验。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肠和肺ILC2 细胞因子和转录因子的表达 肠ILC2 细胞与肺 ILC2 细胞相比，IL-13 mRNA（3.47±0.73 vs 0.97±0.17） 及 IFN-γ mRNA（2.45±0.74 vs 1.08±0.25）表达显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；IL-17 mRNA（1.46±0.90）在肠 ILC2 中高表达而在肺 ILC2 中不表达，但 IL-5 mRNA（0.38±0.12 vs 0.98±0.17）表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；肠 ILC2 转录因子 GATA3 mRNA 表达量升高（1.19±0.23），但与肺 ILC2（0.98±0.17）的差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。以上结果提示肠和肺中ILC2 表达的细胞因子和转录因子差异巨大。

图1 肠和肺中ILC2 细胞因子和转录因子表达

2.2 IL-25 对肠和肺ILC2 细胞体外增殖及活化的影响 EdU 检测结果显示，肠ILC2 在IL-25 刺激下，与肺相比，体外增殖提高约8 倍（43.50±14.89 vs 5.47±2.17），差异有统计学意义（P＜0.05）（图 2A）；IL-25 刺激后肠 ILC2 IL-5 mRNA（3.20±0.91）和 IL-13 mRNA（15.88±8.28）表达水平分别显著高于肺ILC2（1.00± 0.26）、（0.82± 0.10），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图 2B）。以上结果提示 IL-25 可以促进肠ILC2 的活化和增殖。

图2 IL-2 促进ILC2 细胞增殖和活化

2.3 肠和肺ILC2 IL-25 受体表达及IL-25 对ILC2体内增殖的影响 肠ILC2 与肺ILC2 细胞相比，IL17RB（IL-25 受体）mRNA（85.25±22.16 vs 1.43±0.17）表达水平显著升高，而传统ILC2 活化IL1RL1（IL-33 受体）mRNA（0.02±0.01 vs1.07±0.18）表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3A）。分别用 IL-33（500 ng/d）、IL-25（500 ng/d）腹腔注射C57BL/6 小鼠3 天后，EdU 检测结果显示，IL-25 刺激后肠内ILC2 细胞增殖显著增加，而IL-33刺激后肺中ILC2 细胞增殖显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图 3B）。以上结果提示肠 ILC2 高表达IL-25 受体IL17RB，而肺ILC2 高表达IL-33受体IL1RL1，体内实验进一步证实IL-25 是肠ILC2增殖和活化的刺激剂。

图3 肠和肺中ILC2 细胞受体表达及其对增殖的影响

2.4 Notch 信号对IL-25 介导的肠ILC2 体外增殖的影响 real-time PCR 分析肠和肺 ILC2 细胞Notch 信号公认的靶标基因Dtx1 的表达情况，结果显示与肺相比，肠ILC2 细胞Dtx1 mRNA 表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4A）。取GSI 和IL-25 处理后小鼠，在体外培养肠ILC2 细胞中加入Dtx1 抑制剂GSI，肠ILC2 细胞体外增殖显著降低（图4B）。以上结果提示IL-25 介导的肠ILC2细胞的增殖依赖于Notch 信号通路。

图4 Notch 信号对IL-25 活化ILC2 细胞的影响

3 讨 论

ILCs 是一群类似于T 细胞但不同于T 细胞表面表达多种抗原受体的淋巴细胞，ILC2 具有分泌IL-4、IL-5 和 IL-13 等Ⅱ型细胞因子能力的 ILCs[7]。目前，越来越多的证据表明ILCs 具有异质性，如体内注射IL25 或IL-33 可以使得ILC2 具有截然不同的功能，注射IL-25 产生的ILC2 分泌IL-17 及Ⅱ型细胞因子，这种ILC2 被称为 iILC2（inflammatory ILC2s）[8]，而注射 IL-33 产生的 ILC2 仅具有分泌Ⅱ型细胞因子的能力，这种ILC2 被称为nILC2（natural ILC2s）[9]。本研究发现，肠与肺ILC2 的细胞因子和转录因子表达谱不同，由于表达的受体不同，导致肠和肺ILC2 活化的细胞因子亦不相同，Notch 信号可影响肠 ILC2 的活化[10]。

Ⅱ型细胞因子主要发挥促进炎症反应的作用。ILC2 因能分泌大量IL-5 和IL-13，在变态反应性疾病的发病机制中发挥作用；IL-33 滴入野生型小鼠鼻腔后，小鼠肺能快速产生大量IL-5 和IL-13[11]。虽然IL-4 和IL-9 亦为ILC2 分泌的主要细胞因子，但为了后续更好研究变态反应性疾病以及比较IL-25与IL-33 对不组织ILC2 的作用，本研究选择检测IL-5 和IL-13 两种细胞因子。本研究发现，肠ILC2的IL-13 等Ⅱ型细胞因子的基础表达显著高于肺ILC2，而IL-5 基础表达则显著低于肺ILC2（图1）；IL-25 刺激后，肺 ILC2 的 IL-13、IL-5 的表达与基础表达相比均无显著变化，但肠ILC2 的IL-13、IL-5的表达分别升高约5 倍和3 倍（图1、2），显示IL-25可以活化肠ILC2，同时可解释肠ILC2 中IL-5 基础表达显著低于肺ILC2，活化后显著高于肺ILC2 的原因。同时，肠ILC2 的细胞因子IFN-γ 和IL-17 则显著升高，Ⅱ型转录因子GATA3 虽然上升，但与肺相比无显著性差异（图1）。大量文献证实[12-13]，肺中ILC2 的增殖与活化主要依赖于IL-33 及其受体IL1RL1，而IL-25 能显著提高肠ILC2 而非肺ILC2细胞的增殖与活化能力（图2），提示不同组织ILC2的异质性。本研究进一步发现肠ILC2 高表达IL-25受体 IL17RB，而肺 ILC2 高表达 IL-33 受体IL1RL1，从而可解释IL-25 活化肠ILC2 细胞能力的原因。最后，本研究发现Notch 信号作为重要的转录驱动因子在诱导ILC2 细胞可塑性方面发挥重要作用。首先我们发现，Notch 信号通路的靶蛋白基因Dtx1 表达在肠ILC2 中显著增高，Dtx1 抑制剂GSI处理可抑制IL-25 对ILC2 增殖的促进作用。

综上所述，肠ILC2 细胞通过其IL-25 受体IL17RB 与IL-25 结合，表现出与肺ILC2 不同的增殖反应和细胞因子表达谱，同时肠ILC2 这种依赖于IL-25 的作用受到Notch 信号通路调控。肠道中这种既具有ILC2 又具有ILC3 双重功能细胞是哮喘或流感等许多自身免疫性疾病和炎症性疾病的重要驱动因素，为治疗上述疾病提供新靶点和理论依据。