角蛋白酵解工艺研究进展

摆倩文， 张邵博， 李 儒， 马咸莹， 诺如·以扎·诺丁， 陈士恩*， 丁功涛*

(1.西北民族大学 生物医学研究中心中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030;3.兰州海关 技术中心，甘肃 兰州 730030；4.马来西亚标准与工业科学研究所 工业生物技术研究中心，马来西亚 雪兰莪州莎亚南 40700)

角蛋白广泛存在于生物体中,是一种可再生资源,作为家禽加工的副产品而大量生产，可转化为一种动物能消化的膳食蛋白质[1]。在畜禽屠宰场，每年都会有角、羽毛、蹄等畜禽副产物，且大多没有得到合理的利用与开发而被废弃。据2017年统计，我国一年的畜禽屠宰量高达约8 363 万吨，其中牛屠宰后的一些不可食的废弃物约有65 万吨，占总量的9%；羊屠宰后的废弃物约有50 万吨，占总量的11%；猪屠宰后的废弃物约有318 万吨，占总量的8%；家禽屠宰后的羽毛、血等废弃物约有312 万吨，占总量的17%。这些废弃物不仅污染环境，同时造成资源浪费。因此，为减少污染，提高利用率，促进环境向友好型发展转变，开发新的蛋白质资源成为当今的研究热点。角蛋白作为一类材料力学特性良好的生物可降解天然高分子,已经在多个领域表现出良好的应用前景。本文对角蛋白的微生物降解及其展望进行综述。

1 角蛋白与角蛋白酶概述

1.1 角蛋白

角蛋白(Keratin)属于不完全蛋白，不溶于水和酸性溶液，不被一般蛋白酶所分解，实质为纤维状硬蛋白，是人或动物外胚层细胞的结构蛋白，其来源丰富，包括皮肤及皮肤衍生物等[2]，主要存在于人的毛发，动物的角、蹄、羽毛等副产物中。角蛋白与其他植物源性蛋白、胶原蛋白等相区别的一个重要特征是其结构中含有大量二硫键且富含硫元素2.0%～5.6%，胱氨酸含量约为氨基酸组成的8.2%～15.0%左右，而且角蛋白是一种有较高应用价值的生物蛋白，现在国内所应用的角蛋白基本来源于畜禽的副产物。

角蛋白可以分为α-角蛋白和β-角蛋白。α-角蛋白主要在毛发、羊毛中[3]，是由α-螺旋构象的多肽链构成，具有很好的伸缩性能；而β-角蛋白广泛存在于羽毛中，它是反平行式β-折叠片平行的方式堆积成的多层结构，链间主要以氢键链接，层间依靠范德华力维持，且含有大量甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸等，因此抗张强度高，但不能拉伸[4]。角蛋白还可以根据二硫键含量的多少分为软质和硬质角蛋白，软质角蛋白是存在于细胞内一些组织中的成分，硬质角蛋白一般在畜禽的副产物中。这些角蛋白中的二硫键使其结构更加稳定，具有抗降解性。蛋白质在植物或微生物源性蛋白酶的作用下水解为肽和游离氨基酸，然后氨基酸被降解形成不同的产物，包括氨、有机酸及生物胺等，但是角蛋白的降解主要是角蛋白酶的作用[5]。

1.2 角蛋白酶

角蛋白酶(Keratinase)为专一性降解角蛋白的一类酶，可由微生物产生，能降解多种可溶性及不可溶的蛋白质，如胶原蛋白、纤维蛋白、角蛋白等[6]。畜禽副产物等的废弃物得以降解，是依赖于微生物发酵产生角蛋白酶发挥作用。据报道，角蛋白酶可分为天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶[7]。其中，丝氨酸蛋白酶类中角蛋白酶数量最多，应用也广，主要产自细菌；金属蛋白酶类在微生物中也有不少；天冬氨酸蛋白酶类目前只在人体腐生真菌中有发现，活性中心含有天冬氨酸，可以引起人或动物的某种皮肤病[8]。

1.3 角蛋白的降解方法

一般降解角蛋白的方法有化学水解、物理机械水解和利用微生物降解三种。

1．3.1 化学法 化学水解法包括酸水解、碱水解，还有化学还原法、化学氧化法和铜氨溶液法。酸碱水解过程相似[9]，酸水解是将含有角蛋白的产物与一定比例的酸混合加热水解，然后加碱中和，破坏产物中角蛋白的二硫键来分解角蛋白。化学还原法就是用还原剂将角蛋白中的二硫键还原成巯基，而肽链不断裂，得到可溶性的角蛋白。铜氨溶液法是由于铜氨溶液有很强的碱性且对氢键有一定的分解能力，所以可以降解角蛋白。

1.3.2 物理法 物理方法有高压膨化、高压水解、挤压法和挤出法。物理水解角蛋白一般是应用加热(100～200 ℃)、加压(0.294～0.98 MPa)的方法使角蛋白内部的二硫键断裂水解，从而使其变成可溶的、易消化的多肽混合物和游离氨基酸[10]。陈莹等[7]研究了提取角蛋白的物理方法，通过高压水解和高压膨化来降解角蛋白。结果表明，高压膨化法所需的压力、温度均低于水解法，且耗时短，降解率可达80%。

1.3.3 微生物法 微生物发酵法是一种工序相对简单，经发酵产角蛋白酶对角蛋白进行降解的方法。在天然环境中，自然堆积会发生水解，说明环境中存在能降解角蛋白的微生物[11]，微生物分解角蛋白是通过分泌角蛋白酶，将角蛋白酶解为氨基酸等蛋白水解物,使通过微生物发酵降解畜禽副产物，提取蛋白水解物成为可能。

1.3.4 角蛋白降解方法比较 角蛋白降解方法比较见表1。采用化学法和物理法，废弃物的利用率无法保证。所以研究一种既环保又能提高角蛋白营养价值的方法降解角蛋白促进畜禽副产物的利用率成为热点。

2 微生物发酵工艺

2.1 工艺流程

原材料及菌株→筛菌(初筛和复筛)→菌种鉴定→原材料为底物发酵培养基与条件优化→角蛋白降解率。

2.2 不同微生物降解角蛋白

目前已发现大量能分解角蛋白的微生物，包括部分真菌、放线菌和细菌，见表2。

表1 角蛋白降解方法比较

Sangali等[25]在厌氧系统中分离出1株弧菌菌株kr2，它是一种能降解角蛋白的中温细菌，属于弧菌科, 是从家禽工业废料中分离出降解羽毛的细菌，该弧菌在含有天然羽毛的肉汤中培养时产生了很高的角质溶解活性，细菌生长的最佳pH值为7，温度为30 ℃，羽毛粉的消化率高达82%。Kim等[26]从家禽粪便中分离出降解羽毛的细菌,在这些分离株中，有3株被鉴定为枯草芽胞杆菌。聂康康[27]以短小芽胞杆菌WHK4为材料，以羽毛作为碳氮源进一步发酵产酶来降解羽毛角蛋白。经过优化工艺结果显示，羽毛角蛋白降解的最佳pH为8.0，菌龄为18 h，摇床180 r/min，发酵60 h时降解率达52.0%；如果用羽毛粉代替羽毛，其降解率可达74.4%。虽然有大量微生物被发现能降解一些天然角蛋白[28]，但仍然存在对副产物等的废弃物利用率低的问题，很难广泛利用，所以要筛选对角蛋白分解率高的菌株。李雷等[29]选用通过紫外和化学方法诱变得到的具有高活性蛋白酶的菌株，枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)UMU4和短小芽胞杆菌(B.pumilus)SCU11，通过种子培养过夜，分两组实验，按3%的比例在发酵培养基中分别接入培养好的菌株，37 ℃、200 r/min摇床发酵6 d，每天离心取上清液进行测定，分析其分解效率、氨基酸含量。结果发现，菌株SCU11能更高效地利用羽毛，其羽毛降解率是菌株UMU4的1.2倍，降解率分别为85%和70%，第5天时约有65%的羽毛转化为可溶性肽和氨基酸。傅伟[3]以羽毛作为唯一的碳氮源，地衣芽胞杆菌ZJUQH作为材料菌种，在基础培养基中加入羽毛粉，250 mL摇瓶发酵，4～5 d后羽毛完全被降解。采用正交试验设计对几个主要影响条件进行优化，结果表明，当地衣芽胞杆菌细胞的生长温度为40 ℃，发酵时间48 h，反应pH值为7.5时，发酵产酶结果最佳，产角蛋白酶活力高达85.8 U；而当反应pH为7.0时，羽毛降解率最高，达84.06%。

表2 产角蛋白酶的微生物类型

研究发现降解角蛋白的微生物多存在于细菌且降解效果最佳。由于细菌种类较多，生长繁殖快，产量高，具有较强的适应性，用于降解角蛋白，所得角蛋白酶活性较真菌和放线菌高且降解率更好。虽然微生物发酵筛菌过程繁琐，优化工艺复杂，但是相比较化学和物理方法，微生物发酵法消化率较好，效果较好，还能提高废物利用率保证高营养价值。

2.3 影响微生物发酵的因素

研究发现影响微生物发酵的主要因素为温度、pH值和接种量，微生物发酵产酶所需的条件均不相同，但在特定的最优条件下，会达到最佳降解率。蔡成岗[30]测定了pH值对菌株降解羽毛角蛋白的影响，结果表明，pH值对产酶量和酶活都有影响。在不同pH值条件下，菌株的生长情况不同，pH值在7.5～8.0的中性至弱碱性条件下，产酶量呈上升趋势；当pH值为7.5时，酶活达到最大；pH值超过8.0，酶活随着pH值的升高而降低。因此，在微生物发酵过程中，经工艺验证探究出适宜的发酵条件极为重要。聂康康[27]测定了温度对菌株KD-N2降解角蛋白的影响，发现温度对于产酶量和酶活均有影响。当培养温度为23 ℃时，菌株KD-N2的产酶率最高；当温度低于23 ℃时，菌株生长速度慢，产酶量降低；当温度超过28 ℃，菌株生长速度快，产酶时间短，但随着发酵时间的增加，酶活性降低。所以，要选择适宜的温度降解角蛋白。该研究还表明，适量的接种量可以促进菌株的生长繁殖，并促进角蛋白酶的产量。随着浓度的增加，角蛋白酶活性降低，接种量在2%时角蛋白酶产量达到最高。常培伟[31]研究表明，发酵底物中的碳、氮源对微生物发酵产酶量有影响。碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要功能是提供微生物菌体生长繁殖所需必要营养物质，合成菌体所需的碳骨架以及提供菌体合成目的产物的原料。氮源主要用于构成菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物[32]。徐恒星等[33]实验结果表明，葡萄糖作为辅助性碳源对菌体降解角蛋白具有明显促进作用，麦芽糖和乳糖则抑制降解，而辅助性的氮源对降解角蛋白不利。

3 角蛋白的应用

3.1 农业

我国每年都会因大量富含角蛋白的废弃物而造成环境污染，通过降解角蛋白来获得所需的产物，会产生角蛋白酶，增加土壤肥性，使角蛋白得以利用。含氨基酸水溶肥料是新一代集高科技多功能与环保于一体的液体肥料，可为植物提供更全面的营养，可做叶面肥、浓缩肥、液态肥原料。张荣飞等[34]研究结果显示，添加0.08%～0.12% 的角蛋白酶可以显著提高断奶仔猪的日增重和饲料转化效率，且血清中的白蛋白水平提高了20%。

3.2 饲料

动物的饲料大多是由谷类、蔬菜及肉类组成，但是这些物质很难被吸收消化。而角蛋白水解物中富含大量游离氨基酸，可溶性蛋白和游离氨基酸可丰富饲料营养，经过降解之后能给动物提供营养，促进氨基酸的吸收，使动物生长得更好，从而增加了饲料的利用率。

3.3 其他

角蛋白在其他领域也有应用，如化妆品、纺织品、医用等。角蛋白具有良好的亲肤性和吸附性，应用于化妆品，能帮助活性因子透过皮肤屏障，实现皮肤的深层护理，在皮肤美容领域具有良好的前景[35-37]。利用角蛋白酶对角蛋白的特异酶解反应对副产物进行加工，使其结构构象改变,可改善营养功能[38-40]。同时可溶性蛋白作为填充剂应用于皮革，能赋予皮革较好的柔软性和丰满性，高活力的角蛋白酶可应用到皮革脱毛以及医药等行业。

4 展 望

天然的动物角蛋白存在范围较广，能应用于各种行业领域。因具有优异的生物学特性和良好的材料力学性能，角蛋白已经在材料、生物、医学等方面得到比较广泛的应用且拥有良好的前景。在我国屠宰场废弃物是角蛋白的一大产源地，但却不能很好地利用，这限制了角蛋白在工业化生产中的实际应用。为了提高畜禽废弃物利用率，增加角蛋白的营养价值，产生高效能角蛋白酶，让角蛋白更多地应用在各行各业，将角蛋白的综合利用价值挖掘出来，将会是一个很有前景的环保举措；选择高效降解角蛋白的菌株是微生物发酵的重要前提，开发出降解效率高、加工工艺简单且成本低的产品及微生物蛋白水解物酶的生物学特性研究仍是今后的研究热点。