四霉素对茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria ribis室内毒力测定及其田间防效试验

郭春丽， 赵新海

(1.辽宁微科生物工程股份有限公司，辽宁 朝阳 122000;2.辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

杨树是人造木板和纤维用材的主要加工原料，同时对植树造林、生态恢复、风景绿化和防风固沙具有重要作用。我国是世界上杨树人工林面积最大的国家，但多种病虫害的发生制约了杨树林产业的可持续发展。据统计，已报道的导致杨树病害的病原菌种类达300多种，其中茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeriaribis引起的杨树溃疡病危害较重[2-5]，在我国各地普遍发生。杨树溃疡病菌为弱寄生菌，寄主范围非常广泛，具潜伏侵染特性，发展速度快，分布面积广，危害日趋严重，防治难度大[6]，已成为发展我国杨树人工林的严重障碍，制约我国林业可持续发展[7]。目前在防治杨树溃疡病方面主要采用杨树抗溃疡病育种和药剂防治两种方法进行[8-9]。 四霉素是不吸水链霉菌梧州亚种的代谢产物[10]，主要有效成分包括A1、A2、B和C四大组分，其中A1和 A2两个组分属于多烯大环内酯类四烯抗菌素；B组分为白诺氏菌素 (Albonoursin)，属于环肽类抗菌素； C组分为茴香霉素 (Anisomyein)，属于含氮杂环类、芳香族衍生物类抗菌素。大量研究表明四霉素对多种植物病原菌有较高的抑制活性[11-12]，是一种高效低毒的生物农药，在林业病害防治应用中对多种林木腐烂病、溃疡病、黑斑病具有良好防治效果[13-15]，具有促进患病部位愈合、弱苗根系生长、老化根系再生、提高作物自身抗病力等优点。本研究采用菌丝生长速率法测定四霉素对杨树溃疡病菌的室内活性，通过刮治喷涂法进行田间防效试验，旨在为进一步明确四霉素对茶藨子葡萄座腔菌的抑菌效果及对其导致的杨树溃疡病防治效果，从而为规模化防治杨树溃疡病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeriaribis，辽宁省微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 供试树种 银中杨。

1.1.3 培养基 PDA培养基：马铃薯(去皮)切块200 g，煮沸20 min，过滤留取汁液，加入葡萄糖20 g，琼脂18 g，用蒸馏水定容至1 000 mL，pH自然，121 ℃灭菌30 min，冷却备用。

1.1.4 供试药剂 ①试验药剂：15%四霉素母液(tetra mycin)、0.3%四霉素水剂，均由辽宁微科生物工程股份有限公司制备;②对照药剂：10%多抗霉素(polyoxin) B可湿性粉剂，陕西先农生物科技有限公司生产，市售。

1.1.5 器械 壁纸刀，背负式喷雾器，毛刷，自喷漆。

1.1.6 试验地基本情况 试验地点位于锦州市凌海三台子镇四丰村，该地区杨树溃疡病病原以茶藨子葡萄座腔菌为主；试验面积15 hm2，树龄8 a，行距4 m×3 m，土壤类型为壤土，pH 7.1；水肥条件良好，中等管理水平。施药当日(2018年5月3日)天气晴，最高气温20 ℃，最低气温8 ℃，施药后7 d内无降雨。

1.2 方法

1.2.1 室内毒力测定 ①病原菌菌种培养:将茶藨子葡萄座腔菌接种于PDA培养基上，(25±1) ℃恒温培养72 h备用。②药剂浓度的配制：依据预备试验结果，分别将15%四霉素和10%多抗霉素B可湿性粉剂稀释至设置浓度(表1)，待用。

表1 试验处理设计

③含药培养基平板的制备：每个500 mL三角瓶中定量加入100 mL PDA培养基，灭菌后备用。将培养基融化冷却至50 ℃左右，无菌条件下，在装有100 mL PDA培养基的三角瓶中加入1 mL表1设置浓度的药剂，混合均匀后倒入培养皿，制成相应浓度的带药培养基平板，设不加药剂的PDA培养基平板作为对照(含等量无菌水)。每个处理4个重复。为保证供试病菌的菌龄相同，使用直径为4 mm打孔器(已灭菌)将事先制备的茶藨子葡萄座腔菌平板沿菌落边缘打成菌饼，无菌条件下，将菌饼转接至各处理含药培养基中央，菌丝面朝上，(25±1) ℃恒温培养。根据对照平板菌落生长情况，采用十字交叉法，用游标卡尺测量各药剂处理组菌落直径。按公式(1)、(2)计算各处理浓度对供试病原菌菌丝生长抑制率(%)，计算结果保留小数点后两位。

A=A1-A2………………………………(1)

式中，

A：菌落增长直径；

A1：菌落直径；

A2：菌饼直径。

式中，

C：菌丝生长抑制率；

B1：空白对照菌落增长直径；

B2：药剂处理菌落增长直径。

④统计分析方法:将抑菌率换算成抑制率的机率值，以各处理浓度的对数为x值，以相应处理对菌丝的抑制率的机率值为y值，用数理统计方法求出供试药剂的毒力回归方程y=ax+b，并以y=5(抑菌率为50%的机率值)带入回归方程，求出EC50(抑制中浓度)、EC90值。

1.2.2 田间防效试验 ①药剂用量与处理：田间防治使用0.3%四霉素水剂，对照药剂选择10%多抗霉素(polyoxin) B可湿性粉剂。试验共设置6个处理，即0.3%四霉素水剂10倍稀释液、0.3%四霉素水剂30倍稀释液、0.3%四霉素水剂50倍稀释液、10%多抗霉素(polyoxin) B可湿性粉剂500倍稀释液、10%多抗霉素(polyoxin) B可湿性粉剂1 000倍稀释液、对照CK喷施清水。试验设置3次重复，共计18个试验小区，每个小区20 m×25 m，内有5～6棵感病杨树。②施药方法：确定试验小区划分后，用自喷漆将患病杨树进行标记。按各处理浓度配置好药剂，施药前用壁纸刀将感病部位的树皮削掉，露出未感染的组织，用毛刷将供试药剂涂抹至患病处，每处反复涂抹5次，每次间隔5～10 min。③调查与防效计算方法：于施药前2d(2018年5月1日)进行病情基数调查，于施药后20 d(2018年5月23日)进行防效调查。调查方法采用数测调查法，在施药前调查记录各小区感病疤块基数，用红色蜡笔划定感病区域；施药20 d后，调查各试验小区内施药杨树上病疤数，进行数据汇总后，计算防效。

2 结果与分析

2.1 四霉素对茶藨子葡萄座腔菌室内毒力测定结果

采用菌丝生长速率法测定四霉素对茶藨子葡萄座腔菌的抑菌效果，结果见表2。试验结果表明，在设置的浓度范围内，供试药剂四霉素对茶藨子葡萄座腔菌的抑制率随有效成分浓度增高而增高，呈明显正相关的线性关系，经回归分析，求得回归方程为y=2.434 4x-0.021 7,r值为0.999 5。其对茶藨子葡萄座腔菌的EC50、EC90分别为114.82 a.i.mg/L、389.05 a.i.mg/L，对照药剂多抗霉素的EC50、EC90分别为134.89 a.i.mg/L、489.78 a.i.mg/L，与对照药剂多抗霉素相比，四霉素对茶藨子葡萄座腔菌的抑菌活性略高。

表2 四霉素对茶藨子葡萄座腔菌菌丝生长的影响

表3 四霉素对茶藨子葡萄座腔菌毒力测定结果

2.2 田间防效试验结果

采用刮治喷涂法，使用0.3%四霉素水剂对茶藨子葡萄座腔菌引起的杨树溃疡病进行田间防治效果试验(见表4)，试验结果表明，0.3%四霉素水剂各浓度处理对杨树溃疡病均具有较好的防治效果，防效达68.25%～82.41%，略优于对照药剂10%多抗霉素对应浓度处理的防治效果。

表4 四霉素防治杨树溃疡病田间药效试验结果

3 讨 论

四霉素作为一种广谱的生物农药，近年来应用范围不断拓展，研究表明四霉素对细菌性杨树溃疡病具有较好防治效果，已在多地开展防效试验，并在实际应用中取得较好效果[14-16]。为进一步挖掘四霉素在林业生物防治中的应用潜力，开展了四霉素对杨树溃疡病病原真菌茶藨子葡萄座腔菌的室内毒力测定和田间防效试验，结果表明四霉素对茶藨子葡萄座腔菌具有较强抑菌效果，EC50和EC90分别为114.82 a.i.mg/L、389.05a.i.mg/L，田间防效达68.25%～82.41%，四霉素对真菌引起的杨树溃疡病也具有较好防效。多种病原菌可以导致杨树溃疡病，按病原物类型可以分为细菌和真菌[17-18]，而不同种类的病原菌在防治时用药类型不同，在实际生产中往往需要对病原菌精准诊断后，有针对性用药才能达到较好的防治效果，而四霉素可以有效防治细菌和真菌引起的杨树溃疡病，在林业病害生物防治中应用前景广阔。