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miR-1247-3p通过靶向抑制B4GALT3促进乳腺癌细胞体外增殖、迁移与侵袭

2020-09-05赵振慧

实用癌症杂志 2020年8期
关键词:小室孔板划痕

李 妍 赵振慧 李 迅

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一[1],虽然近年来乳腺癌的治疗和诊断都有了显著的提高,但是肿瘤转移、耐药、预后较差等问题仍然存在[2]。并且介导乳腺癌发生发展的分子机制研究并不完善,所以发现新的肿瘤生物标志物,并完善其分子机制对于临床的诊断和治疗至关重要。MicroRNA(miRNA)是一类长度约为20~24个核苷酸的小RNA,可通过抑制其靶基因的表达水平而调控生物体内多种生物学进程,包括肿瘤的发生发展[3]。在肿瘤相关的MicroRNA中,miR-1247-3p已经被报道在肝癌等癌症高表达[4],但是其在乳腺癌的表达和作用并没有报道,本研究通过探究miR-1247-3p在乳腺癌中的表达及对乳腺癌增殖和转移的影响,旨在为乳腺癌的研究和治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231(由新疆医科大学提供);乳腺上皮细胞MCF10A(由新疆医科大学提供);Tirzol(南京凯基生物技术有限公司);CCK8试剂盒(沈阳万类生物技术有限公司);EvaGreen miRNA qPCR试剂盒、miRNA cDNA Synthesis 试剂盒(苏州吉玛基因股份有限公司);B4GALT3,GAPDH抗体,山羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司);电泳仪(南京大学仪器厂);微型垂直电泳槽(上海天能科技有限公司);凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司);Transwell小室(福麦斯生物技术有限公司),miR-1247-3p引物、mimic、inhibitor、negative control、B4GALT3的siRNA(由吉玛基因有限公司合成);转染试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)。

1.2 细胞的培养与转染

乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞培养在含有10%FBS的DMEM高糖培养基中,置于5%CO2、37 ℃培养箱,每1至2天细胞换液或传代。取对数生长期的乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231接种于六孔板中,每孔细胞数为1×105,按照转染试剂盒指示,将miR-1247-3p的mimic、inhibitor、negative control(NC)或者 B4GALT3的siRNA与转染试剂混合,然后在不含胎牛血清的DMEM培养基中与MCF7和MDA-MB-231共孵育8h,再用完全培养基培养24 h。

1.3 乳腺癌细胞中RNA的提取

培养乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞至密度为80%,消化细胞至离心管中,加入Trizol裂解5 min,取上述细胞裂解液加入200 μl氯仿,静置5 min后,于12 000×g,4 ℃离心15 min,转移上层水相,加入500 μl异丙醇,12 000×g,4 ℃离心10 min,去上清,1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后,20 μl RNA-free水重悬RNA沉淀,55 ℃水浴10 min,即为总RNA,使用核酸定量仪检测总RNA含量。

1.4 RT-qPCR检测乳腺癌细胞中miR-1247-3p的表达水平

根据miRNA cDNA Synthesis 试剂盒指示配置反应体系,将提取的乳腺癌细胞RNA逆转为cDNA,然后利用核酸定量仪对cDNA进行定量。然后根据EvaGreen miRNA qPCR试剂盒指示配置反应体系,进行qPCR反应,采用GAPDH作为内参,反应后采用2-ΔΔCt法计算miR-1247-3p的表达量。

1.5 细胞增殖实验

消化转染后的乳腺癌细胞,稀释细胞至50000个/ml,将上述细胞接种至96孔板,每孔100 μl,每组三个复孔,并将细胞培养2~4 h,使乳腺癌细胞完全贴壁,然后每孔加入10 μl的CCK8溶液,继续37 ℃培养,分别于24 h、48 h、72 h用酶标仪检测各孔450 nm处的吸光度,OD值越大,细胞增殖能力越强。

1.6 细胞划痕实验

消化转染后的乳腺癌细胞,稀释细胞至300000个/ml,然后将各组细胞分别接种至96孔板,每孔30000个细胞,每组3个复孔,培养至细胞完全贴壁,然后用无菌的白色枪头在96孔板的中央轻轻划痕,划痕后立即用PBS清洗细胞,并在每孔加入无血清的DMEM培养基,显微镜下观察并拍照,然后放入培养箱中继续培养,于24 h后观察并拍照,计算划痕愈合率,划痕愈合率越高,细胞迁移能力越强。

1.7 细胞侵袭实验

4 ℃融化Matrigel胶,每个Transwell小室加入100 μl Matrigel胶,轻轻摇晃使胶在小室底部覆盖均匀,37 ℃培养箱中放置30 min,使Matrigel胶充分凝固。用不含血清的DMEM培养基重悬转染后的乳腺癌细胞,并稀释细胞至5000个/200 μl,并取200 μl细胞接种至Transwell小室中,小室放置于24孔板,24孔板每孔加入600 μl完全培养基,使小室底部浸入培养基,将24孔板于培养箱中培养24 h后,取出小室用PBS清洗,小室底部用无水乙醇固定30 min,晾干后用结晶紫对小室底部染色10 min,清洗晾干后,在显微镜下观察拍照,每孔拍5张照片,并用Photoshop软件计数,比较各组侵袭的细胞数目,细胞数目越多,细胞侵袭能力越强。

1.8 miR-1247-3p靶基因的预测

在miRDB和microT-CD两个数据库中分别查找miR-1247-3p的靶基因,取两个数据库中的靶基因的交集,并使用Targetscan软件根据数据库提供的信息对靶基因进行置信水平分析,取置信水平最高的靶基因。

1.9 荧光素酶报告实验验证靶基因

采用荧光素酶报告实验鉴定预测到的靶基因和miR-1247-3p的靶向关系,具体步骤为:设计pGL3质粒载体,将靶基因构建在荧光素酶基因的前边,将空白pGL3质粒(pGL3-Control)、含靶基因pGL3质粒(pGL3-B4GALT3 WT)、以及阴性对照pGL3质粒(pGL3-B4GALT3 MUT)(质粒的设计和构建由广州博瑞生物有限公司完成)转染进入293T细胞,并且将miR-1247-3p的mimic及NC转染至上述293T细胞,培养24 h后,使用Dual Luciferase 试剂盒检测荧光强度,若miR-1247-3p能够与靶基因结合,则抑制下游荧光素酶的表达,荧光强度降低。

1.10 Western blot检测乳腺癌细胞中B4GALT3表达水平

取各组转染miR-1247-3p mimic、inhibitor、NC后的乳腺癌细胞加入1 ml的Trizol研磨均匀,加入1.5 ml的异丙醇,12 000×g,4 ℃离心10 min,去上清,用蛋白清洗液清洗3次后,用1%的SDS溶液重悬沉淀,即为总蛋白。BCA蛋白定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,用5%的脱脂牛奶对PVDF膜封闭2 h,然后以稀释后的GAPDH、B4GALT3一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗膜后二抗室温孵育1.5 h,再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液,并将PVDF膜浸入发光液中反应半分钟,曝光并拍照,用Image J软件曝光结果进行定量分析。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 qPCR检测乳腺癌细胞miR-1247-3p的表达水平

根据qPCR检测结果(图1):miR-1247-3p在乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的表达量显著高于乳腺上皮细胞中的表达量(P<0.001),提示乳腺癌细胞或可通过高表达miR-1247-3p而促进其自身的生长。

图1 qPCR检测miR-1247-3p在乳腺癌细胞及乳腺上皮细胞中的表达水平

2.2 miR-1247-3p促进乳腺癌细胞的增殖能力

如图2所示:转染miR-1247-3p mimic的乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的OD值显著高于对照组,而转染miR-1247-3p inhibitor的乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的OD值显著低于对照组,提示miR-1247-3p表达上调可显著提高乳腺癌细胞的体外增殖能力。

2.3 miR-1247-3p促进乳腺癌细胞迁移能力

细胞划痕检测乳腺癌细胞迁移能力结果(图3)显示,转染miR-1247-3p mimic后MCF7和MDA-MB-231的划痕愈合率显著提高(P<0.001);转染miR-1247-3p inhibitor后MCF7和MDA-MB-231的划痕愈合率显著降低(P<0.001),提示miR-1247-3p能够在体外显著提高乳腺癌细胞的迁移能力。

2.4 miR-1247-3p促进乳腺癌细胞侵袭能力

细胞侵袭检测结果(图4)显示:相比于NC组,miR-1247-3p mimic组细胞数目显著增加(P<0.001),而inhibitor组则显著减少(P<0.001),提示miR-1247-3p能够显著促进乳腺癌细胞的侵袭能力。

2.5 miR-1247-3p靶基因预测结果

根据miRDB和microT-CD数据库筛选并评价miR-1247-3p靶基因结果,选取置信度最高的B4GALT3,并且预测到 miR-1247-3p与B4GALT3mRNA的结合区域。

2.6 荧光素酶报告实验验证靶基因结果

荧光素酶报告实验结果(图5)显示:miR-1247-3p mimic能够使pGL3-B4GALT3 WT组荧光强度显著下降(P<0.001),而pGL3-Control组和pGL3-B4GALT3 MUT组荧光强度无显著变化,说明B4GALT3为miR-1247-3p的靶基因。

2.7 miR-1247-3p抑制乳腺癌细胞B4GALT3表达水平

Western blot结果(图6)显示:相比于NC组,转染miR-1247-3p mimic的MCF7和MDA-MB-231细胞B4GALT3表达显著降低(P<0.001);而 miR-1247-3p inhibitor组表达显著升高(P<0.001);说明miR-1247-3p能够显著抑制乳腺癌细胞B4GALT3表达水平。

2.8 下调B4GALT3促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

如图7、8、9所示,当转染siRNA抑制B4GALT3表达时,乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的增殖能力显著上升;细胞划痕愈合能力显著上升;细胞侵袭数目亦显著上升;说明B4GALT3表达量下调能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力;而miR-1247-3p能够显著下调B4GALT3的表达水平,提示miR1247-3p能够通过下调其靶基因B4GALT3的表达而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。

图2 CCK8检测MCF7和MDA-MB-231增殖能力

图3 细胞划痕检测MCF7和MDA-MB-231迁移能力

图4 细胞侵袭能力检测结果

图5 荧光素酶报告实验预测靶基因结果

3 讨论

乳腺癌作为1种高发于女性的癌症,是女性癌症死亡的第二大原因,预后较差,平均5年的生存率仅为27%[5-7];临床上的化疗、放疗等治疗虽然可以控制肿瘤的原位生长[8],但是对肿瘤的转移的治疗效果并不显著,尤其时在预防和防止复发方面更是存在巨大的挑战,因此寻找到新的参与乳腺癌发生和发展的生物标志物,为临床的诊断和治疗提供新的思路至关重要。miRNA是一类内源性的[9],由20~24个核苷酸组成的非编码RNA,其作用机制主要是通过结合mRNA3'-UTR而抑制靶基因的表达[10],在基因的表达中起到负调控的作用,且人类基因组中约1/3的编码基因受miRNA的调控[11],近年来逐渐有研究表明,肿瘤组织中miRNA的差异表达是造成肿瘤发展的重要原因[12];而在本研究发现miR-1247-3p在乳腺癌细胞中显著高表达,提示miR-1247-3p可能在肿瘤的生长和转移中发挥作用。

本研究通过CCK8法检测乳腺癌细胞的增殖能力,发现过表达miR-1247-3p能够显著提高乳腺癌细胞的增殖能力,低表达miR-1247-3p则抑制;通过细胞划痕实验评价乳腺癌细胞的体外迁移能力,发现过表达miR-1247-3p乳腺癌细胞的迁移能力显著提高;并且通过细胞侵袭实验也发现过表达miR-1247-3p促进乳腺癌细胞的侵袭能力。

为进一步探究miR-1247-3p促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制,本研究通过生物信息学的预测并通过荧光素酶实验验证其靶基因为B4GALT3,且Western blot检测结果表明过表达miR-1247-3p能够抑制B4GALT3的表达;目前,B4GALT3已经被报道在肝癌中发挥促癌作用[13],但其在乳腺癌中的作用尚未有详细报道,而本研究首次发现抑制B4GALT3的表达能够促进乳腺癌细胞增殖、迁移以及侵袭的能力。

图6 Western blot检测B4GALT3表达水平

图7 下调B4GALT3促进乳腺癌细胞的增殖

图8 下调B4GALT3促进乳腺癌细胞划痕愈合

图9 下调B4GALT3促进乳腺癌细胞的迁移能力

综上所述,miR-1247-3p可通过抑制B4GALT3的表达而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,但是其下游的精细机制还需进一步探讨。

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