亲水作用色谱-串联质谱法测定乳及乳制品中三聚氰胺

2020-09-04刘新辉李鑫张帅周秀芝申玉金王情情

邵阳学院学报（自然科学版） 2020年4期

刘新辉，李鑫，张帅，周秀芝，申玉金，王情情

(山东拜尔检测股份有限公司，山东潍坊，261000)

蛋白质常规测试方法为凯氏定氮法，即通过测定含氮量来间接估算蛋白质含量，这样可通过添加含氮量高的化合物来提高蛋白质的含量水平。三聚氰胺(melamine)是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，含氮量约66%，通过添加三聚氰胺会提高食品的蛋白质测试含量，而且会使劣质食品通过食品检验机构的检测[1]，因此，单独检测三聚氰胺是发现违法添加的关键。GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》规定了高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱/质谱法这4种检测方法。在高效液相色谱法中需使用离子对试剂置换色谱柱硅胶上面的键合相，以达到分离的效果。而离子对试剂会吸附在色谱柱填料的活性位点上，难以被冲洗下来，导致柱子的死体积增加，出现保留时间提前，理论塔板数降低，分离度变差的情况。这个吸附过程是不可逆的，大大降低了色谱柱的使用寿命[2];气相色谱-质谱联用法及气相色谱-质谱/质谱法需经衍生处理，步骤繁琐，成本高，且前处理用到的乙酸铅毒性较高，对实验人员的潜在危害较大[3];液相色谱-质谱/质谱法前处理过程得到的提取液澄清度较差，增加了固相萃取过程的难度，经加标验证相对标准偏差常超出10%的标准要求。

本研究简化了前处理过程，适用于大批量样品的筛查，采用内标法定量可获得稳定的结果，Poroshell 120 HILIC色谱柱使用常规反向溶剂即可获得良好的保留与分离效果[4]，是一种简便、快速、准确检测乳及乳制品中三聚氰胺的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、乙酸、乙酸铵均为色谱纯，购自德国CNW公司;三聚氰胺(货号：C14861400)购自德国Dr.Ehrensorfer标准品公司;三聚氰胺-C13内标(货号：OP061)，购自德国WITEGA标准品公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290Ⅱ-6495QQQ(配有电喷雾离子源(ESI)及Masshunter Quantitative B.08.00数据处理系统)，购自美国Agilent公司;AS-E40UVT-R纯水仪，购自重庆奥思德仪器设备有限公司;MULTI REAX涡旋振荡器，购自德国Heidolph公司;ME 240E分析天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;3K15冷冻离心机，购自德国sigma实验室离心机股份有限公司;Dispensette®Organic分液器及移液枪，购自德国BRAND公司。

1.3 标准溶液配制

分别称取三聚氰胺及三聚氰胺-C13内标标准物质各10 mg(精确到0.01 mg)用50%甲醇水溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制成1.0 g/L的标准储备液，在-20 ℃下保存待用;吸取1 mL的标准储备液于50 mL容量瓶中，以50%甲醇水将其稀释定容为20 μg/mL的标准中间液，吸取标准中间液250 μL于50 mL容量瓶中，以50%甲醇水将其稀释定容为100 ng/L的标准工作液，于4 ℃下避光保存;按同样方式将内标稀释为1 000 ng/mL的内标工作液，于4 ℃下避光保存。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Poroshell 120 HILIC色谱柱(3.0×10 mm，2.7-Micron)。流动相:A为5 mmol/L乙酸铵水溶液，B为乙腈;流速0.45 mL/min;柱温35 ℃;进样量2 μL。采用梯度洗脱程序:0～2 min，90%B;2～3 min，90%～60%B;3～4 min，60%B;4～5 min，60%～30%B;5～6 min，30%B;6～6.5 min，30%～90%B;6.5～8 min，90%B。

1.4.2 质谱条件

三重四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)，温度设定为325 ℃，采用多反应监测(MRM)模式进行分析，正离子扫描，干燥气、鞘气流速均为10 L/min，鞘气温度为350 ℃。具体的质谱条件如表1所示。

表1 三聚氰胺及三聚氰胺内标的质谱检测条件Tab.1 The mass spectrometric detection conditions for melamine and internal standard material

1.4.3 样品前处理

1)称样及预处理。液态乳及乳饮料:称取5.00 g样品(精确至0.01 g)于50 mL比色管中，加入内标工作溶液100 μL。

乳粉:称取2.00 g样品(精确至0.01 g)于50 mL比色管中，加入内标工作溶液100 μL。

奶酪、奶油、巧克力、奶糖:称取2.00 g样品(精确至0.01 g)于研钵中，加5.00 g海砂充分研磨后[5]，一并转移到50 mL比色管中，加入内标工作溶液100 μL。

2)提取。于比色管中加入10 mL 2%乙酸水溶液，涡旋混匀10 min，40 ℃超声溶解10 min[6]。用乙腈定容至50 mL刻度处，涡旋混匀2 min。静置5 min后过0.22 μm滤膜后待测定。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选取

三聚氰胺的分子结构上有三嗪母核，母核上氢被氨基取代，而呈现碱性[7]。其logP只有-1.37(logP指某物质在正辛醇和水中的分配系数比值的对数值)，是一个极性很强的物质，微溶于水，可溶于乙酸、乙腈。考虑到ESI+模式的检测条件和初步沉淀蛋白质的作用，故选用2%乙酸水溶液作为提取溶剂。

2.2 沉淀蛋白方法的确定

常用的沉淀蛋白的方式有酸沉淀法、有机溶剂沉淀法、沉淀剂沉淀法。本研究采用HILIC亲水作用色谱，采用强极性固定相，结合高比例有机相/低比例水相来达到保留强极性化合物的目的。考虑到与初始流动相与亲水作用色谱的兼容性，本研究采用乙腈沉淀蛋白[8-9]。

2.3 色谱和质谱条件的优化

流动相、色谱柱、溶剂效应、色谱梯度条件及化合物性质均会影响色谱分离及保留，HILIC亲水作用色谱适合于logP很小或为负值以及带有亲水、离子或可电离的基团的化合物[10]，且高有机相和低水相的流动相组成有利于提高电喷雾离子化质谱的效率。本研究采用Agilent Poroshell 120 HILIC色谱柱进行分离，该色谱柱结合了表面多孔颗粒填料和创新型手性固定相，可提高强极性化合物的通量、分离度及保留[11-12]。分别考察了5和10 mmol/L乙酸铵水溶液、5和10 mmol/L甲酸铵水溶液为流动相水相的分离效果，最终确定5 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈为最佳流动相，在低缓冲盐浓度下，有利于色谱柱维护且保留适中、响应较高、峰型对称。其标准溶液的HILIC-MS/MS总离子流图如图1所示，三聚氰胺及三聚氰胺内标的色谱图及质谱图如图2所示。

图1 标准品总离子流图

图2 三聚氰胺及三聚氰胺内标的色谱图及质谱图

离子源参数优化设置直接影响分析的灵敏度和稳定性，通过优化离子源温度、干燥气温度及流量、鞘气温度及流量、碎裂电压、碰撞能量、其他辅助雾化干燥气等参数[13]。确定以m/z127/85和127/68为定性离子对，以m/z127/85为定量离子对。

采用的安捷伦6495型质谱仪具有新型预四极杆离子传输聚焦技术、弯曲锥形碰撞池以及高能电子倍增管检测器设计，可以大大提高离子的聚焦传输，产生更有效的离子碎片和更高的离子/电子转化率。因本研究前处理未通过固相萃取净化且未经浓缩，6495型质谱仪在低进样量下可保证高灵敏度、稳定性、抗污染能力及降低基质效应的影响[14-15]。

2.4 标准曲线和定量限

取空白试样按照1.4.3的方法制备空白基质溶液，用空白基质溶液将标准工作溶液逐级稀释，得到0.2，1.0，5.0，10.0和20.0 μg/L 的系列标准溶液，按从低到高的质量浓度依次经HILIC-MS/MS测定[16-17]，以三聚氰胺定量离子对m/z127/85的峰面积Y对其质量浓度X(Hg/L)做标准曲线，得到线性方程Y=0.013 563*X-0.073 763，相关系数(R2)为0.999 522 50，线性关系良好。三聚氰胺的检出限(以S/N>3计)为0.002 mg/kg，定量限(以S/N>10计)为0.005 mg/kg。不同试样中所含的三聚氰胺含量水平差异较大，若测定结果超出了本方法的线性范围，需使用初始流动相对样品溶液稀释后再测定。

2.5 精密度、回收率和准确性

将同一份液体乳、乳粉样品分成2份，其中一份作本底，另一份添加不同浓度的三聚氰胺标准溶液后按照本文建立的方法进行处理和测定，每份样品进行6次平行测定，考察方法的回收率和精密度[18]。该方法的回收率为94.2%～104.9%，相对标准偏差(RSD)为1.25%～5.47%，可见方法的回收率高，重现性好;按此方法对编号为CFAPA-QC025A-1的质控样品进行检测，质控样指定值为0.63 mg/kg，实际测定值为0.59 mg/kg，按“Z-比分数”的方式评价，|Z|=0.22。当|Z|≤2时，测试结果满意，可见该方法的准确性高。