复发性血栓与蛋白C基因565位点突变的相关性研究

王海平 张素平 阙敢波 张奕平 刘全芳 张洪彬

（福建省龙岩市第二医院，福建 龙岩 364000）

静脉血栓（venous thromboembolism，VTE）作为临床常见的一种疾病[1]，表现为血液在深静脉腔内异常凝结和管腔阻塞等造成的回流障碍，同时可伴有远端静脉高压、肢体肿胀、疼痛或浅静脉扩张等症状。VTE的早期报道多见于高加索人群。流行性学数据显示亚洲地区VTE的病发率在（14～57）/（1000000人·年），且存在地域差异[2-6]。此外，人口老龄化、手术复杂度增加、剖宫产率上升、肥胖、肿瘤患病率上升等诸多因素使得亚洲地区VTE的发病率成逐年上升趋势，但现有风险因素仍不足以解释VTE的发生。抗凝系统是人类机体重要的防御系统，与纤溶系统共同维持机体出血和缺血之间的平衡。其中，蛋白C作为抗凝系统重要的组成成员，通过阻断因子Va和因子VIIIa活性发挥抗凝作用。此外，蛋白C还参与机体的一些炎性反应。PROC基因编码蛋白C，位于2q14.3，现已发现至少270个突变位点与蛋白C活性相关[7]。根据PROC基因突变情况将蛋白C分为Ⅰ型和Ⅱ型：Ⅰ型表现为蛋白C合成减少，Ⅱ型表现为蛋白C活性降低。565位点突变使得对应碱基由C变为T，编码氨基酸由精氨酸变为色氨酸，最终影响蛋白C活性。目前关于此位点的报道较少，尤其是在中国人群。本文我们报道了福建龙岩地区一个家族两代蛋白C基因565位点突变与VTE的研究。

1 对象与方法

1.1 家系一般资料

先证者，男，汉族，31岁，BMI 22.56，平素体健，无高血压、糖尿病、高血脂、贫血，无过敏史，无抽烟、饮酒，肝肾功能正常，反复下肢深静脉血栓两次，第一次骨折后左下肢深静脉血栓，第二次无诱因出现右下肢肿胀经诊断右下肢深静脉血栓形成。2016-2-13来我院就诊，诉右下肢肿痛2 d。6年前左脚骨折20余天后出现左下肢肿胀疼痛，当地医院诊断“左下肢深静脉血栓形成”，予长期口服华法林钠2.5 mg qn，期间未规律监测INR，2年后自行停药，偶感左下肢酸胀不适。入院行双下肢静脉彩超示：右侧髂总静脉、右下肢静脉多发血栓形成；左侧股总、腘静脉陈旧性血栓形成并血流再通（图2）。予以达肝素钠注射液5000 IU q12h抗凝治疗。2016-2-14行“B超引导右小隐静脉穿刺置血管鞘+下腔静脉滤器置入术＋左下肢深静脉置管溶栓术”，术中尿激酶20万单位灌注溶栓，术后尿激酶溶液25 mL/h经溶栓管泵入溶栓治疗5 d，达肝素钠注射液5000 IU q12h抗凝治疗，2016-2-19停用尿激酶，口服华法林钠片3 mg qn po。2016-2-22局麻下行“下腔静脉滤器取出术”。2016-2-23双下肢静脉彩超示：右侧髂静脉、右下肢深静脉未见明显血栓；左侧股总、腘静脉陈旧性血栓形成并血流再通（图3）。患者要求出院，门诊随访治疗。本研究内容获院内伦理委员会批准，所有家族成员均签署知情同意书。

1.2 生化指标检测：收集4位家族成员外周血进行生化分析，包括血液细胞分析（日本Sysmex2100型血球仪）；肝功能8项（罗氏原装肝功能8项检测试剂盒，罗氏C501全自动生化仪）、肾功能5项（罗氏原装肾功能5项检测试剂盒，罗氏C501全自动生化仪）；凝血四项与D-D二聚体检测（检测方法：凝固法，上海博研试剂盒，美国贝克曼公司型号为ACL TOP 700全自动血凝仪）；蛋白C活性、蛋白S活性、AT活性（检测方法：发色底物法，上海博研蛋白C检测试剂盒，上海博研蛋白S检测试剂盒，上海博研AT-Ⅲ检测试剂盒，美国贝克曼公司ACL TOP700全自动血凝仪）。

1.3 蛋白C基因突变检测：收集4位家族成员外周血进行全基因测序。PCR反应体系10 μL：Vazyme LAmp Master Mix 5μL，ddH2O 3 μL，引物工作液1 μL，样品DNA 1 μL，PCR过程：95 ℃ 3 min，95 ℃30 s、68 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min，20 X -0.5 ℃退火/cycles，95 ℃ 30 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min，16 X，72 ℃ 10 min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、割胶后，用琼脂糖DNA纯化试剂盒（上海申能博彩公司）回收并纯化，末端标记双脱氧法进行正向和（或）反向测序，对所发现的基因突变，重新PCR扩增相应的片段，反向测序证实。

图1 家系图

图2 2016-2-13多普勒彩超图

图3 2016-2-23多普勒彩超图

1.4 抗凝血酶Ⅲ基因突变检测：收集4位家族成员外周血进行抗凝血酶Ⅲ全基因测序。PCR反应体系10 μL：Premix prime STAR 5 μL，ddH2O 3 μL，引物工作液1 μL，样品DNA 1 μL，PCR过程：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、68 ℃ 15 s、72 ℃ 60 s，20 cycles，95 ℃ 30 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 60 s，16 cycles，72 ℃ 10 min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、割胶后，用琼脂糖DNA纯化试剂盒（上海申能博彩公司）回收并纯化，末端标记双脱氧法进行正向和（或）反向测序，使用Chromas软件将SERPINC1测序结果与Genbank序列X68793.1作比对分析，对所发现的基因突变，重新PCR扩增相应的片段，反向测序证实。

2 结果

2.1 先证者抗凝治疗监测：先证者出院后进行门诊抗凝治疗，服药期间患者依从性好，定期复诊，INR持续控制在2.0～3.0（图4）。

图4 先证者INR监测统计图

2.2 家族成员生化指标检测结果：生化指标显示，先证者除了蛋白C活性下降明显外，其PT、APTT、TT、FIB、AT、蛋白酶S活性均正常。其他家族成员中，先证者的父亲（I-1）和哥哥（Ⅱ-1）的蛋白C均活性均下降，PT、APTT、TT、FIB、AT、蛋白酶S活性均正常（见表1）。

表1 先证者及家系成员生化检测

2.3 家族成员蛋白C基因突变检测结果：Chromas软件分析蛋白C基因检测经正反测序结果：家族4名成员中有3位成员蛋白C基因565位点存在基因突变：先证者的父亲（I-1）、先证者的哥哥（Ⅱ-1）和先证者（Ⅱ-2）的蛋白C基因565位点为杂合突变型（图5）。

图5 蛋白C基因突变检测

2.4 家族成员抗凝血酶Ⅲ基因突变检测结果：全基因组测序结果中家系所有成员抗凝血酶基因7个外显子及其侧翼内含子未发现异常。

3 讨 论

目前，国内外研究逐渐开始关注PROC基因565位点突变与VTE的相关性。Liang等[7]研究发现565位点突变与血栓风险相关，基因突变个体静脉血栓风险增加8.8倍（95%CI:1.1-71.6），携带565T等位基因个体蛋白C缺陷风险增加，检测PROC基因对患者血栓风险评估会获益。Tong[8]等研究显示对于亚洲人群，565位点突变通过影响蛋白C活性增加VTE风险，对于这一位点的突变，亚洲地区人群应更为重视。

本研究报道了一例家族性蛋白C基因突变与VTE的研究。家族成员中有3位蛋白C基因565位点存在突变。先证者临床表现为反复血栓事件发生，考虑蛋白C基因565位点是血栓高发的易感因素。介于本研究家族体系人数的限制，后续拟将扩大人群样本，在中国人群中对蛋白C基因565位点基因多态性与VTE发生风险进行研究，可能将为VTE的预防和治疗做一提示。