基于网络药理学探讨黄芪治疗骨质疏松症的分子机制

韩林静 吴克亮 王宏波 肖庆华 张震 朱建宗 林晓生*

1.广州中医药大学，广东 广州 510405

2.深圳宝安第二人民医院(集团)总医院，广东 深圳 518104

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨密度降低，引起骨脆性增加、易发骨折为特征的全身性代谢性骨病[1]。其发病率与年龄呈正相关关系[2]。随着人口老龄化程度的不断加剧，OP在全世界范围内已经成为继心血管疾病、糖尿病之后发病率排第三的慢性疾病。据相关研究[3]报道，我国40岁以上人群OP发病率约为25%，预计到2050年，我国OP患者将达到2.12亿，严重影响我国人民的身体健康。

黄芪为常用补气药，性味甘微温，《神农本草经》将其列为“上品”，具有补正气、壮脾胃等功效。OP的病位在肾、脾及经络，肾虚是发生OP的根本原因，脾虚是其发展的诱导因素。脾虚不能运化水谷，水谷之精不能充养先天肾精，筋骨失养加速骨质疏松的发生。补脾益气是防治骨质疏松的基本法则之一，因此在OP的防治组方中，黄芪作为基础药物存在，据统计[4]，黄芪的组方使用频率位列第三位。大量研究表明[5-10]，黄芪内的活性成分能够多通路促进成骨细胞的增殖与分化，提高成骨细胞活性，并能通过雌激素通路抑制破骨细胞重吸收，改善骨质疏松，但对于黄芪抗OP的具体机仍不十分明确。因此，对黄芪的有效成分、作用机制进行微观分析，将有利于黄芪的进一步开发利用，也为从补脾法入手治疗骨质疏松症提供可能的理论依据。

网络药理学(network pharmacology)是由英国的Hopkins在2007年提出的，其基本原理主要是通过高通量成分筛选、分子交换验证、结合网络分析等技术揭露并构建“药物-靶点-基因-疾病”之间复杂的网络关系，同时分析、预测药物的可能作用机制，最终结合相应的实验来检验模拟预测的机制。该理念打破了传统的“单个药物-单个靶点-单个疾病”的思想，是一种先进的、系统的研究思想。

1 材料与方法

1.1 黄芪成分及潜在靶点获取

通过中药药理学系统数据库 (traditional Chinese medicine system pharmacology,TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜索黄芪的化学成分，按口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30及类药性(drug-likeness,DL)≥0.18进行筛选[11-13]，并将筛选结果在TCMSP数据库逐一进行作用蛋白靶点预测提取。

1.2 靶点名称标椎化

将TCMSP数据库筛选所得所有蛋白靶点名导入UniProt数据库(https://www.uniprot.org)，设置物种为人类(Human)，筛选作用人类蛋白靶点名并转换成标椎的基因名。

1.3 疾病靶点获取

通过GeneCards(https://www.genecards.org)及OMIM在线数据库(https://www.omim.org)，输入“Osteoporosis”，“Osteopenia”进行搜索与骨质疏松症相关的基因，设置关联分数(Relevance score)≥10，结果导出为Excel文件。

1.4 抗OP活性成分筛选

将人类靶点的基因名与疾病相关基因名进行对比匹配处理，共同靶标结果就是黄芪治疗骨质疏松症的关键靶点基因，反向筛选出抗OP潜在活性成分，并使用R软件(Version R x64 3.5.1)绘制维恩图。

1.5 黄芪-活性成分-基因靶点-疾病网络构建

将活性成分、基因靶点导入Cytoscope 3.7.0，构建药物-活性成分-靶点基因-疾病可视化网络，网络中节点(node)代表疾病、药物、靶点基因、活性成分；边(edge)用来连接疾病与基因、基因与活性成分、活性成分与药物的关系，节点的大小与连接度值呈正相关关系。

1.6 蛋白靶点互作(PPI)网络建立

将黄芪抗OP关键靶点基因输入STRING数据库(http://string-db.org/cgi/input.pl，Version11.0)，设置物种为人类(Homo spaiens)进行构建，设置可信度为中等可信(medium confidence)，隐藏未连接的节点，其他参数数据库保持系统推荐设置，进行蛋白互作分析，获取蛋白互作关系网络。

1.7 GO生物过程与KEGG富集分析及通路建立

将关键靶点基因输入到DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp，Version6.8)，选择物种为人类(Homo spaiens)，进行GO生物过程(gene ontology-biological process，GO-BP)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路富集，以P<0.05进行靶基因筛选，分析黄芪发挥药理作用的生物过程及主要信号通路。

2 结果

2.1 黄芪的主要成分及潜在靶点获取

依据OB≥30%、DL≥0.18的标椎，筛选出黄芪的主要化学成分有20种，其中M374未匹配到到靶点，见表1。去除重复，共预测到潜在靶点218个，通过Uniprot数据库标椎基因名转换后，共得到180个作用人类的基因靶点。通过Genecards、OMIM数据库共检索到与OP相关基因199个，相匹配映射得到黄芪抗OP靶点共22个，见图1。

表1 黄芪的主要成分及其OB和DL值Table 1 The main components of Astragalus and its OB and DL values

图1 黄芪靶点与OP靶点匹配维恩图注：左侧表示OP相关靶点，右侧表示黄芪作用靶点，重合部分表示黄芪潜在抗OP 靶点。Fig.1 Venn diagram of the targets of Astragalus and OP matching

2.2 “黄芪-活性成分-基因靶点-疾病”网络构建

将黄芪活性成分、靶点基因、疾病导入Cytoscape软件，构建黄芪-活性成分-靶点基因-疾病可视化网络，见图2，节点图形大小与连接度值呈正相关，其中M098与20个靶点相连接,可能是黄芪治疗OP最重要成分，M354、M378、M392、M417、M422均与4个及以上靶点连接，见表2。

2.3 PPI及Hub蛋白确定

将OP相关靶点基因导入string在线数据库，设置隐藏未连接的靶点，得到蛋白互作PPI网络，见图3。节点表示蛋白靶点，边表示靶点间作用关系。包含节点22个，边140条，连接度值平均为12.7。利用Cytoscape插件中Degree算法确定度值前6为Hub蛋白，其中IL6、ESR1、MMP9等13个蛋白度值均大于平均值，见表3。

2.4 GO-BP分析和KEGG通路建立及分析

GO-BP结果分析(图4)显示，22个靶点基因主要参与了transcription factor activity，RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding(转录因子活性,RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合，7个基因)、receptor ligand activity(受体配体活性，6个基因)、RNA polymerase II transcription factor binding(RNA聚合酶II转录因子结合，5个基因)等多个过程；KEGG通路富集(表4)显示在Rheumatoid arthritis(类风湿关节炎)、IL-17 signaling pathway(IL-17信号通路)、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路)、Osteoclast differentiation(破骨细胞分化)过程中，均有7个靶点基因参与。

图2 “黄芪-活性成分-靶点基因-疾病”网络注：图中圆形代表疾病，六边形代表靶点，三角形代表活性成分，菱形代表黄芪。Fig.2 "Astragalus-Ingredients-Targets-OP" Network

表2 黄芪治疗OP的活性成分及潜在作用靶点Table 2 Active ingredients and key targets of Astragalus in treating OP

图3 蛋白相互作用PPI网络Fig.3 Protein Interaction PPI Network

表3 蛋白互作网拓扑结构分析结果Table 3 Protein interaction network topology analysis results

图4 黄芪抗OP生物过程图注：仅显示富集结果前20的过程。Fig.4 Astragalus anti-OP biological process diagram

表4 KEGG通路富集结果Table 4 KEGG pathway enrichment results

3 讨论

中医学认为骨质疏松症属于“骨痿”范畴，其发生主要与肾虚、脾虚、血瘀相关[14]。脾为后天之本，气血生化之源，主肌肉，运化水谷充养肾精，营养肌肉骨骼。脾虚合并肾虚时，后天不足，运化无力，后天不能充养先天，加重骨骼失养，加速OP的发生。再有，脾虚则气血生化无源，气虚鼓动无力致血瘀。血瘀的病理产物瘀血又会加重脾虚、肾虚，进一步加重骨质疏松症的发生。因此，补脾益气是治疗骨质疏松症和预防骨质疏松骨折的基础。

本研究中筛选出20种黄芪化学成分，其中作用于骨质疏松症的活性成分有9种，分别是：quercetin(槲皮素)、kaempferol(山萘酚)、isorhamnetin(异鼠李素)、Jaranol、3,9-di-O-methylnissolin、formononetin、Calycosin、(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol、7-O-methylisomucronulato。槲皮素能够与20个骨质疏松靶点相结合，多通路发挥抗OP效用。顾艺婧等[15]研究表明，槲皮素能够抑制骨细胞衰老，提高骨小梁数量，从而达到治疗绝经后骨质疏松症的效果；另外槲皮素还能够激活ERK磷酸化，从而使骨髓间质干细胞增殖过程的到促进，发挥成骨作用[16]。山萘酚具有雌激素样活性，能够促进成骨细胞增殖活化过程。研究[17]也证实山萘酚能够体外提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性，促进大鼠成骨细胞的增殖与分化过程。在促进大鼠成骨分化，提高骨密度，改善骨微结构的治疗效果上要好于槲皮素[18]。异鼠李素也是黄芪抗OP重要成分之一，作用途径是增加骨矿密度及体积，提高骨小梁厚度及数量，降低骨小梁间距，具有防止去卵巢大鼠骨质疏松的作用[19]。

PPI蛋白互作网络显示，靶蛋白之间是通过多途径、相互调节、共同作用的过程，而非单独发挥作用的作用机制。Hub蛋白是指高连通蛋白，是药物发挥生物学效应的关键靶点。IL6是一种多效应性细胞因子，能够起到抗炎和免疫调节等作用。通过对活动期类风湿关节炎患者的研究[20]显示，RA造成的骨质流失，与循环中细胞因子水平升高有关，内源性细胞因子(RANKL和IL6)可直接抑制成骨细胞增殖和分化，另外还能够刺激破骨细胞形成。ESR1为雌激素受体α的编码基因，是骨质疏松雌激素通路上的重要靶点基因。ESR1可调节骨代谢和峰值的获取，抑制骨丢失，在骨生长和骨量维持中发挥重要作用。雌激素受体与雌激素结合后，能够激活破骨细胞下游信号通路Fas/ FasL，从而诱导破骨细胞发生凋亡[21]。另外ESR1基因多态性与骨质疏松症也有关[22]，原因是染色体6P25.1区上的某些基因型突变可能直接与骨形成有关；MMP9基质金属蛋白酶家族的一员，动物实验[23]显示MMP9与骨量相关。MMP9基因缺失，可提高骨小梁连接密度，而MMP9高表达则呈现破骨细胞吸收能力增强，骨质疏松的表现。

GO-BP结果显示黄芪抗骨质疏松成分作用的靶点蛋白功能主要集中在RNA转录、配受体活性方面。异常的转录翻译将导致下游编码蛋白的变异及功能异常，使细胞内外配受体结合障碍，不能发挥正常的生物功能。KEGG富集分析结果显示，破骨细胞分化、类风湿关节炎、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路和雌激素信号通路可能是主要作用通路。基于此，笔者认为黄芪抗骨质疏松的主要作用机制就是以上过程。在类风湿关节炎通路中，AP1可以通过RANKL/RANK通路影响破骨细胞分化过程,该通路是骨质疏松的经典过程，成骨细胞来源的RANKL可以与破骨细胞RANK结合，从而诱导破骨细胞的分化与成熟[24]。在破骨细胞分化通路中，黄芪可能是通过直接和间接两个路径。直接路径中活性成分直接作用于特异性破骨细胞因子c-FOS,抑制破骨细胞分化[25]；间接路径中作用于核内的转录子PPARγ,PPARγ[26]可促进骨髓间充质细胞向脂肪细胞转换，从而导致骨髓脂质代谢紊乱，使间充质细胞向成骨细胞转化减少，破骨细胞分化成熟增多，两者平衡被打破，发生骨质疏松。因此笔者认为，黄芪在破骨细胞通路上可能是通过抑制PPARγ表达和增强c-FOS表达实现的。IL-17信号通路中主要作用于AP-1、IL6、IL1β、MMP3、MMP9等因子，有雌激素参与诱导IL-17分化可能是骨质疏松的新机制，雌激素能够逆转IL-17直接刺激成、破骨细胞的作用[27]，表现出破骨细胞成熟分化被抑制，受抑制的成骨细胞矿化被解除。Dixit等[28]的研究也证实，抗IL17抗体能够增强骨骼再生，提高损伤部位成骨标志物表达水平，降低氧化应激反应，在骨质疏松性骨折中能促进骨愈合及再生的潜力。AGE-RAGE信号通路中黄芪作用于IL1、IL6、MMP2、STAT1,3、AP1等因子，该过程可能是通过AP1参与的MAPK信号通路间接调节骨细胞发挥抗骨质疏松作用，晚期糖基化终末产物(AGEs)在一定的环境下可促进骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)的磷酸化，提高MAPK的蛋白表达，加速EPCs向成骨细胞分化，该成骨细胞的分化过程主要与MAPK通路中的p38和JNK相关[29]。MAPK通路还可参与消化系统的生物过程，具有保护胃粘膜上皮细胞的作用。另外，通路富集结果中Toll样受体信号通路、炎症性肠病通路，PI3K-Akt信号通路等与消化系统、脾脏相关通路的出现，可能是黄芪从脾治疗骨质疏松症的重要证据。

综上所述，通过网络药理学分析，黄芪抗骨质疏松的分子机制是多成分、多分子、多路径的共同作用、相互作用的复杂过程；不仅直接参与骨代谢，还间接通过消化系统、循环系统、内分泌系统等影响骨微环境，调节骨代谢，这也体现了中医学整体观念的理念。另外，大量文献报道结果与本研究方法中的成分、靶点、通路相一致，也证实了本研究方法的可靠性。但是，本次研究结果中也显示出很多未知的分子通路及作用机制，需要深入研究，这也为进一步从补脾方向研究骨质疏松症提供了一定的参考。