培本固疏方对去势大鼠骨代谢及骨生物力学的影响

孙菁 李佳洋 沈沐瑶 朱媛媛 徐道明 郭海英* 王昕玥

1.南京中医药大学，江苏 南京 210023

2.江苏省中医院，江苏 南京 210000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种慢性、全身性疾病，随着骨组织中骨矿物盐含量的减少而增加患者骨折风险，并直接导致患者日常生活能力(ADL)和生活质量(QOL)的降低[1]。近年来，人口老龄化速度骤增，2016年中国60岁以上的人口骨质疏松患病率为36%，预计至2050年，全世界65岁以上的人口将增加到15.55亿，届时骨质疏松性骨折的发生人数将增加到626万，相应的医疗支出高达1 745亿元，可见骨质疏松已成为中国面临的重要公共卫生问题[2-3]。过去的10年里，中医药治疗作为一种简便易行、经济有效的疗法，在一定程度上可以提高骨密度以及改善患者的生活质量[2,4]。本文中的培本固疏方是郭海英教授从临床经验中总结的自拟方，从正虚络瘀的角度治疗骨质疏松症，临床运用多年且安全有效。RANKL/RANK/OPG作为骨吸收的经典通路,OPG可以竞争性地与RANK结合，从而抑制破骨细胞分化，影响骨吸收[3]。本研究通过选取大月龄大鼠切除双侧卵巢建立骨质疏松症模型，观察培本固疏方对模型大鼠血清骨代谢指标及骨生物力学相关指标的影响，探讨培本固疏方治疗骨质疏松的可能作用机制，以期为中医药治疗骨质疏松症提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：选取健康6月龄SPF级雌性未孕SD大鼠42只，体重约(290±20)g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2018-0006。大鼠饲养在南京中医药大学清洁级动物实验中心，室温为(22±2)℃，湿度在40%～60%。实验过程受南京中医药大学动物实验伦理委员会监督，动物实验伦理号为201905A022。

1.1.2试剂与仪器：中药培本固疏方由龟板、鹿角片、人参、仙桃草等组成，均采购于南京中医药大学百草堂药房，四味药按2∶1:1∶2比例配伍，两次煎液合并后浓缩，分别制成含生药1、2、4 g/mL的低、中、高不同剂量。西药：阿仑膦酸钠(阿拉丁，货号A115345)。其他试剂：青霉素G钠盐(索莱宝，货号P8420)、水合氯醛(阿拉丁，货号K1820081)、吕氏碱性美蓝染色液(索莱宝，货号G1180)。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)试剂盒(货号JTE64371)、丙二醛(MDA)测试盒(货号JTE69760)、核因子-κB 受体活化因子配体(sRANKL) 试剂盒(货号JTE64083)、骨保护素(OPG)试剂盒(货号JTE60602)、晚期糖基化终末产物(AGEs)试剂盒(货号JTE69177)，以上ELISA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。酶标分析仪(Rayto RT-6100，深圳雷杜生命科学股份有限公司)、数字化双能 X 线骨密度仪(MEDIX-90，法国MEDILINK公司)、生物力学测试仪(MTS Acumen3，美特斯工业系统有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分组及模型建立：将大鼠称重后按体重由轻到重进行编号，将体重相邻6只分为1个区组，各区组内参照随机数字表进行分组，分成假手术组(SHAM)、模型对照组(OVX)、中药低剂量组(D)、中药中剂量组(Z)、中药高剂量组(G)和西药组(X)，每组7只。各组大鼠自由饮食、自然光照，每周称重1次。大鼠在室温(22±2)℃、清洁级环境中适应性饲养1周后，采用去双侧卵巢法建立骨质疏松模型[5]。造模前禁食24 h，称重，左腹部消毒后经腹腔注射10%水合氯醛溶液300 mg/kg麻醉，备皮、酒精消毒后逐层切开，找到鲜红色菜花状卵巢后切除，结扎双侧输卵管及伴行血管，再逐层缝合。假手术组仅切除卵巢旁脂肪组织约1 g。术后各组大鼠均后肢肌注青霉素4万U，连续注射3 d预防感染。去势组术后连续5 d进行阴道涂片，染色后显微镜下观察，均表现为动情间期(大量白细胞及少量上皮细胞)，表示造模成功[6]。

1.2.2干预:各组均于术后1月后施行干预。大鼠等效剂量按成人每日服用剂量的6.3倍进行换算。中药低剂量组:含培本固疏方生药5.302 5 g/(kg·d)进行灌胃；中药中剂量组:含培本固疏方生药10.605 g/(kg·d)进行灌胃；中药高剂量组:含培本固疏方生药21.21 g/(kg·d)进行灌胃；西药组:阿仑膦酸钠水溶液1 mL/(kg·d)进行灌胃；假手术组和模型对照组:给予等容量0.9%生理盐水0.5 mL/100 g进行灌胃。各组药剂均隔水温热后灌胃，灌胃持续8周[6]。

1.2.3标本采集及测定方法：大鼠末次施治后，禁食24 h，次日取材。取材前将大鼠称重，麻醉方法同造模，行腹主动脉取血处死。

1.2.4骨密度检测：将新鲜股骨标本统一方位放于有机玻璃盒支架上固定，股骨全长的1/2处作为股骨中段的测量点，股骨全长的中上1/4处作为股骨近端的测量点，用MEDIX-90双能X线骨密度仪扫描，得出BMD，连续测量2次，计算股骨近端及股骨中段的精确度以变异系数的均方根(RMS-CV)表示分别为：0.006、0.008。

1.2.5三点弯曲试验：用MTS Acumen3 生物力学测试仪进行三点弯曲试验，跨距设为25 mm，加载速度为2 mm/min，直至股骨断裂，根据试验结果绘制载荷-位移曲线。根据曲线图得出股骨弹性模量、弹性载荷、极限载荷。

1.2.6血清代谢指标：血液采集后4 ℃静置4～6 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液。用酶联免疫法(Elisa)检测血清骨代谢指标OPG、sRANKL、TRACP5b的含量以及氧化应激指标AGEs、MDA的含量。

1.2.7子宫指数：仔细剔除子宫周围脂肪组织后称重，计算子宫指数。子宫指数=子宫湿重/大鼠体重×100%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠体质量及子宫指数的比较

因造模及灌胃过程中的种种因素每组各死亡1只，入组6只。剔除死亡大鼠的体重数据后进行比较，各组大鼠造模前体重无差异，具有可比性(P>0.05)。与SHAM组比较，OVX组、X组体重明显高于SHAM组(P<0.05)，子宫湿重(P<0.01)、子宫指数(P<0.01)低于SHAM组，也从侧面证实造模成功。与OVX相比，Z组体重低于OVX组(P<0.05)，子宫指数高于OVX组(P<0.05)。G组体重低于OVX组(P<0.01)，子宫指数高于OVX组(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠体质量及子宫指数比较Table 1 Comparison of body mass and uterus index between rats in each

2.2 培本固疏方对去势大鼠骨密度的影响

与SHAM比较，OVX组股骨近端、股骨中段骨密度均有所降低(P<0.05)；Z组、G组股骨近端、股骨中段骨密度低于SHAM组，但组内比较无明显差异。与OVX组比较，Z组、G组、X组均可以提高骨密度(P<0.05)；Z组、G组、X组两两比较无明显差异。其中西药可以显著提高股骨近端骨密度，效果优于中药。具体见表2。

2.3 培本固疏方对去势大鼠骨生物力学的影响

与SHAM组相比，OVX组、D组弹性载荷、极限载荷、弹性模量均显著低于SHAM组(P<0.01)。与OVX组比较，G组及X组均提高了股骨的弹性载荷、极限载荷和弹性模量(P<0.05)，但Z组仅改善了股骨的弹性模量(P<0.05)，弹性载荷和极限载荷稍有增加，但不具有统计学意义。与X组比较，D、Z组弹性载荷、极限载荷和弹性模量明显低于X组(P<0.05)，G组弹性模量低于X组(P<0.05)，弹性载荷、极限载荷稍低于X组，但不具有统计学意义。具体见表3。

表2 培本固疏方对去势大鼠骨密度的影响Table 2 Effect of Peiben Gushu Decoction on bone mineral density in ovariectomized

表3 培本固疏方对去势大鼠骨生物力学指标的影响Table 3 Effect of Peiben Gushu Decoction on bone biomechanical index of ovariectomized

2.4 培本固疏方对去势大鼠血清骨代谢指标的影响

与SHAM组相比，OVX组大鼠血清骨代谢指标TRACP5b的含量显著高于SHAM组，OPG的含量显著低于SHAM组(P<0.01)，sRANKL含量高于SHAM组但无统计学意义，OPG/sRANKL比值低于SHAM组(P<0.05)。与OVX组比较，Z组TRACP5b含量低于OVX组(P<0.05)，OPG的含量显著高于OVX组(P<0.01)，sRANKL含量低于OVX组(P<0.05)，OPG/sRANKL比值高于OVX组(P<0.05)；G组TRACP5b含量低于OVX组，OPG的含量高于OVX组(P<0.05)，sRANKL含量低于OVX组(P<0.05)，OPG/sRANKL比值高于OVX组(P<0.05)；X组TRACP5b含量低于OVX组(P<0.05)，OPG的含量明显高于OVX组(P<0.01)。详见表4。

表4 培本固疏方对去势大鼠血清骨代谢指标的影响Table 4 Effect of Peiben Gushu Decoction on bone metabolism index in ovariectomized

2.5 培本固疏方对去势大鼠氧化应激指标的影响

与SHAM组对比，OVX组大鼠血清中氧化应激指标MDA、AGEs的含量均高于SHAM组(P<0.01)。与OVX组比较，Z组MDA含量明显低于OVX组(P<0.05)，AGEs含量显著低于OVX组(P<0.01)，G组MDA、AGEs含量均低于OVX组(P<0.05)。与OVX组相比，培本固疏方中药组均可一定程度上改善氧化应激相关指标的含量，Z组优于G组，但两组内比较不具有统计学意义；X组含量与OVX组相当，未能明显改善氧化应激指标的含量。见表5。

表5 培本固疏方对去势大鼠氧化应激指标的影响Table 5 Effect of Peiben Gushu Decoction on oxidative stress index in ovariectomized

3 讨论

原发性骨质疏松症包括因绝经后激素水平下降引发的绝经后骨质疏松症和70岁以上老年人常见的老年性骨质疏松症，两者共同的特点是随着年龄的增长发病率增高，衰老是二者共同的危险因素[2]。文献[7]表明，机体氧化应激炎性反应可导致骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)发生复制性衰老，缩短端粒长度，使其分化能力下降，尤其是使BMSCs成脂分化增强,成骨分化减弱，加速骨质疏松进程。衰老会增强机体氧化应激反应，氧化应激反应亦会促进机体衰老，两者之间形成一种恶性循环，抑制骨形成，促进骨吸收。

《素问·痿论》[8]：“肾者水脏，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”。《证治准绳》[9]：“肾肝俱损，骨痿不能起于床，筋弱不能收将，宜益精缓中”。中医学认为，肝肾不足为本，脾虚不运，气血不能荣于骨肉，发为骨痿，故临床用药多以补肾、健脾为主。《类经·卷六二十七注》[10]：“肾主骨，骨枯则肾败矣。脾主肉，肉陷则脾败矣”。《灵枢·经脉》[11]：“足少阴气绝则骨枯，少阴者冬脉也，伏行而濡骨髓者也，故骨不濡则肉不能著也，骨肉不相亲则肉软却，肉软却故齿长而垢发无泽，发无泽者骨先死”。故笔者认为，此病为慢性病程，病久则易五脏虚，以脾肾为主，《临证指南医案》[12]：“病初在经，久病入络，经主气，络主血……”，气帅血行，气旺则血自循经，气虚则血滞为瘀，瘀久血不生气，加重气虚，气血痹涩，骨肉不相亲，筋弱不用，则发为骨痿。

现代医学认为骨质疏松症形成的原因有二：一是骨形成不足，二是骨吸收增强。骨脆性增加表示骨易发生骨折，通常以骨强度大小定义，骨强度高则脆性小，骨强度低则脆性大，[13]。生物力学已广泛应用于骨强度评定，所以本次研究的主要观察指标为骨密度，同时选取弹性载荷、极限载荷、弹性模量进行骨强度评定。结果表明，培本固疏方能够在一定程度上提高去势大鼠的股骨骨密度、骨强度，降低骨脆性。另外RANKL/RANK/OPG作为骨吸收的经典通路,OPG可以竞争性地与RANK结合，抑制破骨细胞分化。随着年龄的增加，成骨细胞的存活率降低，骨代谢轴失衡，OPG含量降低和RANKL含量增高可能是骨量流失的重要原因之一[14]。本次研究表明，培本固疏方能提高OPG/RANKL的比值以及OPG的含量，说明培本固疏方能促进骨形成，改善骨吸收。衰老作为原发性骨质疏松症的危险因素，可导致机体抗氧化剂含量不足，加速自由基氧化，诱发氧化应激，其中MDA、AGEs含量是反映机体抗氧化能力的重要参数，MDA反映机体脂质过氧化的程度，AGEs反应机体非酶糖基化的程度，本次研究培本固疏方降低了大鼠血清中MDA、AGEs的含量，说明培本固疏方具有一定的抗氧化应激作用[15]。

培本固疏方以人参、龟板、鹿角片、仙桃草四味药组成，方简而精，以扶正通络为治则，补益脾肾，化瘀通络。其中人参为君，固本培元，补脾益气；鹿角片补益肾阳，兼行血消肿，龟板滋肾潜阳、养血补心，二者阴阳同补，均有强筋健骨之功效，共为臣药；仙桃草化瘀通络止痛为佐药。四味药先后天并重，补益脾肾，活血通络，去瘀生新。现代药理学研究[16-18]发现，人参中有多种化学成分能够起到抗氧化、抗衰老作用，比如人参花寡糖可以使多种酶的抗氧化能力增强，人参多糖、人参皂苷能够抑制脂质过氧化,减少机体丙二醛的含量。龟甲可促进软骨细胞Ⅱ型胶原的合成，促进 MSCs(骨髓间充质干细胞)向成骨细胞方向分化[19]。鹿角胶可显著提高去卵巢大鼠的骨密度、骨矿物质含量且成骨细胞数增加显著[20]。仙桃草不仅具有清除体内氧自由基的能力[21]，其有效成分槲皮素能够抑制AGEs与其受体结合或降低细胞中AGEs累积[22-23],维持正常的骨稳态。

基于上述理论基础，结合本次研究的结果，笔者认为培本固疏方可以提高骨强度，降低骨脆性。其可能是通过OPG/RANKL/RANK通路来抑制破骨细胞形成，减缓骨基质吸收，还可能是通过提高机体的抗氧化应激能力来防治骨质疏松，但具体发生机制有待进一步探讨。