脉冲电磁场抗骨质疏松作用及对Smurf1表达的影响

孙智路 尹剑 黄开亮 谭位华 刘静

1.南华大学附属第一医院急诊部，湖南 衡阳 421001

2.南华大学附属第一医院康复医学科，湖南 衡阳 421001

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由多种原因导致的骨密度和骨质量下降，可引发全身性骨折[1]。目前临床治疗OP仍以药物缓解症状为主，雌激素及其受体调节剂、双膦酸盐、降钙素等药物对OP患者的骨丢失症状有一定抑制作用，但大多疗程长，有较多副作用[2-3]。近来多项研究[2,4]表明，脉冲电磁场(pulsed electromagnetic field，PEMF)可有效治疗OP，刺激骨形成，提高骨密度，改善骨强度，且该治疗方法为生物物理手段，副作用小，然而其具体作用机制尚不完全明确。泛素-连接酶E3中Smad泛素化调节因子1(Smad ubiquitin regulator 1，Smurf 1)是泛素连接酶Hect家族新成员，可独立诱导Smad1、Smad5泛素化及降解，与OP发生发展及骨代谢异常密切相关[5-9]。基于此，本研究以去卵巢骨质疏松(ovariectomy osteoporosis，OVX-OP)大鼠为模型，探究PEMF对OVX-OP大鼠的治疗作用及对Smurf1蛋白表达的影响，以期揭示其可能作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:选取6月龄SPF级未孕雌性SD大鼠43只(货号：J001)，体重(300±10)g，购自南京君科生物工程有限公司。饲养条件：室温(24±2)℃、湿度(50±10)%，12 h/12 h光照/黑暗，自由饮水饮食环境下适应性饲养1周。本研究经本院动物实验伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂及仪器：苯甲酸雌二醇注射液(批准文号：国药准字H44023822)购自广州白云山明兴制药有限公司；戊巴比妥钠(批准文号：国药准字H31021724)购自上海上药新亚药业有限公司；盐酸四环素荧光染料(货号：0422-100G)购自浙江联硕生物科技有限公司，钙黄绿素荧光染料(货号：FS1162)购自上海复申生物科技有限公司；蛋白抽提试剂盒(货号：P0028)、BCA蛋白定量试剂盒(货号：P0010S)均购自上海碧云天有限公司；一抗鼠源anti-Smurf1抗体(货号：ab57573)、兔源anti-β-actin(货号：ab8227)、二抗羊抗兔IgG(货号：ab6721)、羊抗鼠IgG(货号：ab205719)抗体购自英国Abcam公司；FC酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；双能X射线实验动物骨密度测定仪(型号：InAlyzer，韩国)购自佰泰科技有限公司；Union2000型PEMF骨质疏松治疗仪(大鼠型)、半自动图像数字化分析仪购自日本尼康公司等。

1.2 方法

1.2.1模型建立：将43只大鼠用2 %戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)经腹腔注射麻醉后，在严格无菌条件下取腰背椎后侧正中切口，钝性分离肌肉组织，摘除33只大鼠两侧卵巢组织，逐层缝合创口，术后青霉素连续注射3 d。其中麻醉致死1只，术后创口感染致死2只，共存活30只，术后6 d将大鼠随机分为模型组(M组)、雌激素治疗组(E组)和PEMF组，每组10只。另10只大鼠只切除卵巢周围与卵巢大小相仿的脂肪组织，为假手术组(S组)。术后各组大鼠分笼饲养，在室温(24±2)℃、湿度(50±10)%、定期紫外线消毒和通风、12 h间隔照明条件下，自由摄取标准饲料和消毒的蒸馏水。术后8周除假手术组外的其他各组大鼠右肱骨骨密度显著降低，提示骨质疏松动物模型造模成功。E组于术后9周采用苯甲酸雌二醇注射液(0.2 mg/kg)进行皮下注射，每两周1次；PEMF组于术后9周采用Union 2000型PEMF骨质疏松治疗仪(大鼠型)进行治疗，设置参数：8 Hz，自动跳转周期为30 s，最大感应磁场强度3.82 mT，每次40 min，1次/d；S组、M组常规饲养，不予以任何处理。治疗8周后，进行相关数据采集及检测。

1.2.2一般状态观察：治疗期间观察各组大鼠生存状态、饮食情况等，称取治疗前后各组大鼠体重。

1.2.3右肱骨骨密度检测：治疗结束后，采用2%戊巴比妥(0.2 mL/100 g)对各组大鼠行腹腔注射麻醉后置于双能X射线实验动物骨密度测定仪平台上，测定其右肱骨骨密度。

1.2.4骨形态计量学检测：大鼠处死前第13、14天分别于皮下注射四环素(25 mg/kg)作为第一次荧光标记，注射后第3、4天分别于皮下注射钙黄绿素(5 mg/kg)作为第二次荧光标记。治疗结束后，采用2%戊巴比妥(0.2 mL/100 g)对各组大鼠行腹腔注射麻醉处死，取右前肢，剔除肌肉及软组织，取适量骨膜于液氮中冻存备用。另继续完整取出胫骨，沿纵面锯开，进行不脱钙骨包埋。采用半自动图像数字化分析仪对胫骨上1/3作静态检测。静态参数包括：骨体积分数(trabecular bone volume ratio,BV/TV)、骨小梁数(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.2.5骨组织Smurf 1蛋白表达量检测:采用免疫印迹(western blot，WB)检测各组大鼠骨组织Smurf 1蛋白表达量。严格按照蛋白提取试剂盒说明提取收集的各组大鼠骨膜组织总蛋白，并采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品进行6 % SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，添加anti-Smurf1(稀释比1∶500)、anti-β-actin(稀释比1∶500)抗体4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜，添加二抗IgG(稀释比1∶5 000)室温孵育1 h，按上述方法洗膜，显色，曝片，观察结果并拍照分析各蛋白条带灰度值，分别以靶蛋白Smurf 1灰度值与内参β-actin灰度值比值为Smurf 1蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

与S组比较，M组、E组、PEMF组大鼠精神状况欠佳，饮食、活动及大小便未见异常。治疗前，与S组比较，M组、E组、PEMF组大鼠体重均明显增加(P<0.05)。治疗后，E组、PEMF组大鼠体重较治疗前均显著降低(P<0.05)；与S组比较，M组大鼠体重显著增加(P<0.05)；与M组比较，E组、PEMF组大鼠体重显著降低(P<0.05)；E组与PEMF组比较，大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠治疗前后体重比较Table 1 Comparison of weight of rats in each group before and after treatment (g,

2.2 各组大鼠骨密度值比较

治疗前，与S组比较，M组、E组、PEMF组大鼠骨密度值显著降低(P<0.05)；治疗后，E组、PEMF组大鼠骨密度值较治疗前显著升高(P<0.05)；与S组比较，M组大鼠骨密度值显著降低(P<0.05)；与M组比较，E组、PEMF组大鼠骨密度值显著增加(P<0.05)；E组与PEMF组比较，大鼠骨密度值差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠治疗前后骨密度值比较Table 2 Comparison of bone mineral density of rats in each group before and after treatment

2.3 各组大鼠形态计量学结果比较

与S组比较，M组大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著降低(P<0.05)，Tb.Sp显著增加(P<0.05)；与M组比较，E组、PEMF组大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著升高(P<0.05)，Tb.Sp显著降低(P<0.05)；E组与PEMF组比较，大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠形态计量学结果比较Table 3 Comparison of morphometric results of rats in each group

2.4 各组大鼠骨组织Smurf1蛋白表达量比较

与S组比较，M组大鼠骨组织Smurf1蛋白表达量显著升高(P<0.05)；与M组比较，E组、PEMF组大鼠骨组织Smurf1蛋白表达量显著降低(P<0.05)；E组与PEMF组比较，大鼠骨组织Smurf1蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)，详见图1、表4。

图1 WB检测大鼠骨组织Smurf1蛋白表达量Fig.1 WB detection of Smurf1 protein expression in rat bone

表4 各组大鼠治疗后骨组织Smurf1蛋白表达量比较Table 4 Comparison of Smurf1 protein expression in bone tissue of rats in each group after treatment

3 讨论

本研究采用大鼠OVX-OP模拟原发性OP，摘除卵巢后，大鼠体内雌激素显著降低，可引起破骨细胞凋亡减少，成骨细胞凋亡增加，发生OP[11]。目前国内外研究发现，PEMF对促进骨形成、抑制骨吸收、改善骨密度具有重要作用，可有效治疗OP。Lei等[13]研究报道，PEMF可提高OVX-OP小鼠椎体骨量，增强其骨结构及骨强度，与OVX组比较，OVX+PEMF组骨形成标志物骨特异性碱性磷酸酶(bone isoenzyme alkaline phosphatase，BALP)、血清骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、I型前胶原n端前肽(N-terminal propeptide of type I procollagen，P1NP)明显升高，腰椎小梁骨质量下降和小梁骨显微结构的恶化减轻，可能与Wnt3a/LRP5/β-catenin和OPG/RANKL/RANK信号通路骨骼基因表达有关。刘西纺等[2]研究报道，极低频脉冲电磁场结合全身振动治疗可提高废用性OP大鼠骨密度，改善骨小梁微结构，提高骨生物力学性能，两者有协同作用，治疗效果优于单一治疗。本研究结果发现，与S组比较，M组大鼠骨密度值、BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著降低，Tb.Sp显著增加；与M组比较，E组、PEMF组大鼠骨密度、BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著升高，Tb.Sp显著降低，与文献报道一致；E组与PEMF组比较，各指标差异无统计学意义，BV/TV可反映骨量变化，Tb.Sp可反映骨小梁的显微结构，提示PEMF可增加骨密度、改善骨形态，与雌激素的作用相似，对OP具有一定治疗作用，提示PEMF在OP的治疗中可能有雌激素样作用。

泛素-蛋白水解酶复合体通路(ubiquitin-proteolytic pathway，UPP)是一种特异性降解胞内调控蛋白的主要途径，具有ATP依赖性，主要由泛素、泛素连接酶和26S蛋白水解酶复合体组成[14]。Smurf1是一种泛素连接酶，具有HECT结构域，属于泛素连接酶Hect家族新成员，在骨形成、胚胎发育和肿瘤发生的调控中发挥重要作用[15]。Smurf1还可优先与Smad1、5接头区域的PPXY结构域结合，诱导其泛素化和降解，而Smad可通过介导转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)或骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)参与骨形成和骨吸收等骨代谢调节[16-20]。Liang等[21]研究报道，抑制成骨细胞中Smurf1表达可促进年龄相关性骨质疏松小鼠模型的骨形成。尚德阳等[22]研究报道，与正常组、假手术组比较，OVX-OP大鼠骨、肾组织中Smurf1/Smurf2 mRNA表达明显降低，下丘脑中表达升高，补肾中药可改善Smurf1/Smurf2 mRNA表达，防治骨质疏松。本研究结果发现，与S组比较，M组大鼠骨组织Smurf1蛋白表达量显著升高；与M组比较，E组、PEMF组大鼠骨组织Smurf1蛋白表达量显著降低，与尚德阳等文献报道[22]不完全一致，与Liang、Zhang等文献报道一致[21,23]。Smurf1蛋白调控骨形成可能存在不同机制，综合文献报道及本研究结果，提示骨组织Smurf1蛋白表达量升高可能与骨质疏松症有关。PEMF可促进骨形成、增加骨密度，防治骨质疏松，可能与骨组织Smurf1蛋白表达下调有关，但有待进一步验证。

综上所述，PEMF可增强骨形成，提高OP大鼠骨密度，改善其骨丢失症状，发挥抗骨质疏松作用，可能与Smurf1蛋白下调表达有关，为临床OP的治疗提供了新的思路。但本研究只是进行了初步探讨，关于Smurf1蛋白下游信号的分子机制尚不明确，还有待进一步深入探究及验证。