花椒精油对1型糖尿病小鼠肠道健康的影响

2020-09-03任廷远陆敏涛陆龙发秦礼康

中国粮油学报 2020年8期

任廷远陆敏涛黄涛陆龙发杨建秦礼康

(贵州大学酿酒与食品工程学院1，贵阳 550025)(贵州玄德生物科技股份有限公司2，贵阳 550016)(贵州省农业生物工程重点实验室3，贵阳 550025)(贵州省农业科学院农业部DUS中心贵阳分中心4，贵阳 550006)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)是芸香科(Rrutaceac)花椒属植物的果皮，属药食同源类物质[1]。花椒精油又叫花椒挥发油，由花椒果皮所提取分子量较小的挥发性精油类物质，颜色以无色或浅黄色为主，提取过程中可以随蒸汽蒸出，是花椒的原次生代谢产物，它对花椒独特的香气具有很大的贡献[2]，其不仅是一种重要的食品添加剂和调味料，也可作为医药、化妆品和农药等的基础原料，具有广泛的开发利用价[3]。近年来，花椒精油的提取、抗菌活性、成分分析已经成为了研究的热点。路纯明等[4]对花椒挥发油进行纯化，获得各纯化组分；并分析这些组份对杂拟谷盗的影响，结果显示能够杀灭这种害虫的成虫，其中β-水芹烯和芳樟醇有较强的杀虫活性。聂霄艳等[5]研究发现花椒精油中β-水芹烯既有驱虫效果，又有触杀作用。W.Choochote等[6]对比花椒精油与其他植物精油对伊蚊的作用效果，结果显示花椒精油可以有效驱除伊蚊达到1 h。王峰等[7]对比了超临界、亚临界萃取法和水蒸气蒸馏法提取的花椒精油的抑菌效果，结果表明不同方法提取的花椒精油均有抑菌效果，其作用效果区别不大，且对金黄色葡萄球菌、浓绿杆菌和伤寒沙门氏菌有良好的抑制作用。弭向辉[8]初步研究了花椒精油的抗肿瘤作用，发现花椒精油能抑制黑色素瘤细胞A375的生长，并观察到黑色素瘤细胞A375体积明显缩小，呈现不规则生长状态，且出现了大量细胞破碎的状况；而且精油的抗瘤细胞作用与其浓度和时间相关。袁太宁等[9]应用花椒精油处理宫颈癌Hela细胞，发现在低浓度的状态下就可以诱导细胞凋亡。另外，花椒精油抗脂质过氧化活性和清除自由基活性的能力比维生素E、维生素C都更胜一筹，而且抗脂质过氧化作用比清除自由基活性稍强[10]。蔡华珍等[11]采用0.1%八角精油、0.08%花椒精油、0.04%桂皮精油作为保鲜剂能使调理鸡肉串在4 ℃下保鲜达20 d, 25 ℃下保鲜16～18 h。

肠道微生态系统是影响动物消化吸收能力的重要因素，肠道菌群平衡有助于提高动物的消化吸收能力[12]。孙琳等[13]研究表明，花椒精油对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)介导溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)小鼠的肠道菌群有益的影响。Castillo M等[14]研究表明，在饲粮中添加3%肉桂醛的植物精油，可显著增加断奶仔猪肠道内有益菌乳酸杆菌数量，能缓解仔猪断奶应激作用；Tiihonen K等[15,16]研究表明，饲粮中添加肉桂醛可调节肉鸡肠道菌群，维持肠道微生态平衡，从而提高肉鸡生长性能。王光富等[17]研究表明，单独添加植物精油和酸化剂较混合添加有助于维持罗曼粉壳产蛋鸡盲肠微生物稳态。Figen等[18]研究表明，大蒜精油和牛至可显著降低肉鸡肠道梭状芽孢杆菌和链球菌数量以上的研究表明，植物精油可抑制肠道有害菌生长，促进有益菌生长，发生改善机体肠道平衡的作用。花椒及花椒麻味物质对机体糖代谢[19]、脂代谢[20]、蛋白质代谢[21]及肠道健康[22]的影响及其机制已基本清楚，而花椒精油对机体肠道的影响研究较少，因此研究花椒精油对肠道健康的影响具有重要意义。

采用STZ诱导建立1型糖尿病小鼠模型，分别从生长状况、理化指标、肠道微环境及肠道微生物等研究花椒精油对1型糖尿病小鼠肠道健康的影响，以期为花椒精油在食品、医疗、功能性食品中的应用提供的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红花椒精油，由陕西韩城产大红袍花椒，经超临界CO2萃取后，用分子蒸馏分离而得，由贵州玄德生物科技股份有限公司提供；昆明种雄性小鼠，SPF级，每只18～22 g，共58只，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(黔)2018-0001；链脲佐菌素(STZ)、DNA凝胶回收试剂盒、粪便DNA提取试剂盒、荧光定量试剂盒、短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、异酸)标准品、巴豆酸、丙氨酸标准品。

1.2 仪器与设备

DW-HL398超低温冷冻储存箱、PHS-3E3C精密pH计、S1000 梯度 PCR 仪、气相色谱仪GC-2010，Staibilwax-DA毛细管色谱柱、L5S紫外-可见光光度计、Nano Drop 1000微量紫外分光光度、Light Cycler Nano 荧光定量 PCR 仪、740血糖仪。

1.3 动物饲养与样品采集

动物实验过程严格遵循现行的贵州医科技大学实验动物伦理委员会批准的相关法律法规进行(SYXK(黔)2018-0001)。将58只SPF级，18～22 g，雄性小鼠适应性喂养1周后，按体质量随机分为空白组(n=10)和造模组(n=48)，禁食不禁水12 h，造模组(n=48)一次性腹腔注射150 mg/kg STZ造模，空白组腹腔注射等剂量的柠檬酸缓冲液，注射后第3天，禁食10 h，尾尖采血，测量其空腹血糖值，血糖值高于11.10 mmol/L时则造模成功[19-21]，并筛除建模失败的小鼠。把40只建模成功的小鼠根据随机区组法按血糖值分为4组(n=10)，模型组0 mg/(kg·d)、高剂量组15 mg/(kg·d)、中剂量组9 mg/(kg·d)和低剂量组3 mg/ (kg·d)。每天上午10:00灌胃，空白对照组和模型组灌胃等剂量的大豆油，实验期间自由饮食和饮水，每天记录饮食饮水量。每3 d称1次小鼠体质量，并调整灌胃量。饲喂28 d后，禁食12 h，眼眶取血后，解剖，取出肝脏、肾、脂肪、肓肠等组织；其中肓肠称重后，从一端纵切开，讯速将内溶物分装于灭过菌的1.5 mL试管中，置于液氮中保存；肓肠壁于4 ℃水理盐水中洗净，吸水纸吸干后称重及测量表面积。

1.4 花椒精油的处理

为保证每只小鼠为等剂量灌胃(40 g体重小鼠灌胃0.2 mL剂量)，准确称取1.2 g红花椒精油，加入400 mL大豆油后，充分混匀，配制成3 mg/mL花椒精油溶液，分别用大豆油稀释成1.8、0.6 mg/mL的花椒精油溶液，用于高(15 mg/mL)、中(9 mg/mL)、低(3 mg/mL)剂量组的灌胃浓度，空白组和模型组灌胃等剂量大豆油，每3 d配一次，于4 ℃保存。

1.5 饲料效率计算公式[1,22]

1.6 盲肠壁表面积的测定

参照游玉明等[22]方法进行，将剪切下来的盲肠洗净后，从一端纵切开，用小刀将其全部展开平铺在带有刻度的坐标纸上，用铅笔沿盲肠壁的边缘描绘。用剪刀沿线条剪下画线的部分，并称重。将称重结果带入表面积计算公式，算出盲肠壁面积。

式中：A0为剪下轮廓纸的质量；A为1 cm2的坐标纸的质量。

1.7 血糖值的测定

在给药后的0、14、28 d，禁食不禁水6 h，使用血糖仪剪尾采血测定FBG[19-21]。

1.8 盲肠内容物pH[23]

称取0.5 g盲肠内容物于离心管中，加入质量比体积为1∶10的蒸馏水，震荡2 min；3 500 r/min，离心10 min，取上清液用精密pH计测量其pH。

1.9 盲肠内容物游离氨含量[22,23]

准确称取丙氨酸标准品10 mg，加入少量蒸馏水溶解后定容至100 mL，得到丙氨酸标准液母液。分别吸取配好的丙氨酸标准母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于比色管中，加入pH=8.0磷酸盐缓冲溶液0.5 mL和 2% 茚三酮溶液0.5 mL，再加入蒸馏水至2 mL，于沸水浴中加热15 min，静置15 min，用移液枪吸取0.2 mL稀释至5 mL，于570 nm波长下测定吸光值。根据结果求得回归方程为y=0.184 4x-0.017 5，相关系数R2=0.990 2。

盲肠内容物经过处理后，分别吸取1 mL至比色管中，加入配好的磷酸缓冲液0.5 mL和2%茚三酮溶液0.5 mL，于沸水浴中加热15 min，冷却后吸取0.2 mL稀释到5 mL，于570 nm波长下测定吸光值。

1.10 盲肠内容物游离脂肪酸的测定

参照李明泽等[22,24]方法进行，称取0.5 g盲肠内容物加入10 mol/L氢氧化钠溶液(含有巴豆酸5 mmol/L)2 mL，混匀静置30 min，在4 ℃，4 000r/min下离心15 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤上清液后，用气相色谱法进行测定。

色谱条件为：Staibilwax-DA毛细管色谱柱(30 m × 0.2 mm, 0.5 μm)；升温程序：90 ℃保持0.5 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持7 min；进样量1μL载气流速0.95 mL/min，进样口温度220 ℃，FID检测器，检测器温度230 ℃；氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min。

1.11 盲肠内容物微生物检测

取一份盲肠内容物，按照粪便细菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取其中细菌DNA，测定浓度及纯度，保存于-20 ℃环境下备用。参照文献设计各肠道菌群特异性PCR引物[25,26]，在BLAST基因库内(www.ncbi.nlm.nih.gov)比对引物序列特异性。各引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。其定量测定采用20 μL反应体系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL, 10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板2 μL，双蒸水6 μL。反应条件为：95 ℃条件预变性5 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环，同时进行高分辨率溶解曲线实验。各基因引物序列及产物长度如表1。

表1 各细菌引物序列及产物长度

1.12 数据处理

本实验结果以 mean±SD 表示，各组间差异显著性采用SPSS 16.0 软件分析，各组间比较采用单因素方差分析，用Duncan法分析显著性，P<0.05被认为有显著差异。

2 结果与分析

2.1 花椒精油

花椒特殊的香味，主要源自花椒皮中贮存的挥发性成分，称为挥发油或者精油，是花椒香气的主要组成成分[27]。由图1可知，韩城红椒精油颜色为浅黄色，而金阳青椒精油颜色为无色，各自均具有典型的芳香味，两者均无麻味，但青椒精油苦味明显大于红椒精油。本实验使用的红花椒精油，由贵州玄德生物科技股份有限公司采用陕西韩城产大红袍花椒，经超临界CO2萃取后，用分子蒸馏分离而得。

图1 花椒精油

2.2 花椒精油对小鼠生长状况的影响

由表2可知，与空白组相对，模型组体质量增加量和饲料效率显著(P<0.05)降低，而日均采食量显著(P<0.05)升高；与模型组相比，花椒精油能显著(P<0.05)提高小鼠体重增加量和饲料效率，高剂量和中剂量采食量显著(P<0.05)降低。结果表明，灌胃花椒精油后，采食量减少，但饲料效率有所增加，说明花椒精油能够促进小鼠对饲料的消化利用率。

表2 花椒精油对小鼠体重、采食量及饲料效率的影响(n=10)

2.3 花椒精油对糖尿病小鼠血糖的影响

由表3可知，饲喂期间空白对照组小鼠空腹血糖始终维持在正常范围内(4～6 mmol/L)，模型对照组血糖值则大于11.1 mmol/L，说明造模成功且比较稳定。与模型组相比，灌胃花椒精油14 d后，高、中、低剂量组空腹血糖均显著下降(P<0.05)，其中高剂量组由20.03下降到17.45，下降了12.86%；中剂量组由19.46下降到17.97，下降了7.67%；低剂量由21.07下降到19.55，下降了7.22%。灌胃28 d后，各剂量组血糖进一步下降，与0 d相对，高、中、低剂量组分别下了19.09%、9.12% 和9.56%(P<0.05)。说明花椒精油对糖尿病小鼠具有显著的降糖效果，其机制有待进一步研究。

表3 花椒精油对糖尿病大鼠血糖的影响 (n=10)

2.4 花椒精油对小鼠盲肠及其微环境的影响

花椒精油对糖尿病小鼠盲肠及其微环境的影响如表4。与空白相比，模型组盲肠总质量、盲肠壁质量和盲肠表面积均显著(P<0.05)增加，分别增加了39.66%、58.82%、18.99%；游离氨显著(P<0.05)增加了36.23%，pH显著(P<0.05)增加了7.95%。与模型组相比，高剂量和中剂量的花椒精油可显著降低盲肠总质量，分别降低了15.50%和12.07%；高、中、低剂量的花椒精油均显著降低盲肠壁质量，分别降低了23.53%、29.41%、23.53%，可显著降低盲肠内容物游离氨的含量，分别降低了16.64%、21.80%、21.65%；均有降低盲肠内容物pH的趋势，其中高剂量降低显著(P<0.05)；有降低盲肠表面积趋势，但不显著。说明，花椒精油可以改善因STZ诱导的盲肠组织肿大，减少游离氨、酚类物质等对肠道上皮伤害，具有维持因STZ诱导的1型糖尿病小鼠肠道健康的作用。

表4 花椒精油对小鼠小鼠盲肠及其微环境的影响 (n=10)

2.5 花椒精油对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的影响

花椒精油对糖尿病小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的影响见表5。与空白组相比，模型组盲肠内容物中丙酸、丁酸、戊酸和SCFA均显著(P<0.05)降低，分别降低了34.39%、37.93%、20.86%和32.40%；异丁酸有降低趋势，但不显著。与模型组相比，花椒精油可显著(P<0.05)增加小鼠盲肠内容物中丙酸、丁酸、戊酸和SCFA的量，而对异丁酸的影响不显著。实验表明，剂量组对短链脂肪酸的含量增加有显著的效果，并且增加的效果由花椒精油的浓度增加而增加。

表5 花椒精油对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的影响(n=10)

2.6 花椒精油对小鼠盲肠内容物中微生物的影响

花椒精油对糖尿病小鼠盲肠内容物中微生物的影响见表6。与空白组相比，盲肠内容物中乳酸杆菌、双歧杆菌和梭菌均显著(P<0.05)降低，分别降低了38.99%、28.22%、11.75%；拟杆菌也有下降(2.86%)趋势，但不显著。显著增加肠杆菌和肠球菌的量，分别增加了29.69%、26.09%。与模型组相比，花椒精油可显著增加乳酸杆菌和双歧杆菌的量；高、中、低剂量组乳酸杆菌分别增加了22.71%、14.53%、11.86%；而双歧杆菌的量分别增加了12.07%、5.42%、4.80%。高、中、低剂量组可显著(P<0.05)降低肠杆菌的量，分别降低了7.25%、4.60%、3.57%；高和中剂量组可显著(P<0.05)降低肠球菌的量，分别降低了17.73%、9.78%。结果表明，花椒精油有促进盲肠内容物中有益菌的生长，抑制有害菌的生长。

表6 花椒精油对小鼠盲肠内容物中微生物的影响(n=10) log10copies/g

3 讨论

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以高血糖为特征的代谢紊乱性疾病群，主要包括1-型、2-型和妊娠性糖尿病[28]，1-型是胰岛素分泌绝对不足引起的，2-型是胰岛素分泌相对不足或受体受阻引起的[17]。链脲佐菌素(STZ)通过葡萄糖转运体(GLUT2)进入β细胞，引起DNA烷基化，进而使β细胞发生坏死，减少或终止动物胰岛素分泌，导致血糖升高，因其造模成功率高、死亡率低、稳定、作用机制清楚而被广泛用于诱导动物实验性糖尿病[29,30]。本实验采用一次性腹腔注射150 mg/kg bw STZ一周后，就出现多饮、多食、多尿、体重减轻，同时活动量明显减少、精神萎靡、体毛蓬松等典型的糖尿病症状[31-33]。实验期内模型对照组血糖值始终大于11.1 mmol/L，说明造模成功且比较稳定[19-21]。与模型对照相比，高、中、低剂量花椒精油均有显著的降低空腹血糖的效果，这可能与花椒精油中含有烯烃类和酮(醛)类等物质有关[27]。甘芝霖[34]研究表明，同样作为调品味使用的孜然(CuminumcyminumL.)精油中Y-萜品烯可以显著降低2-型糖尿病大鼠血清中糖化血红蛋白、甘油三酯及胆固醇的含量水平，并显著提高胰岛素的含量，从而对2-型糖尿病起到一定的治疗作用。 Farrokhfall K等[35]研究肉桂植物精油的主要活性成分肉桂醛降糖机制，肉桂醛可通过改善胰岛细胞的氧化应激和炎症状态，防止胰岛β-细胞损伤，推测花椒精油降血糖的作用机制可能与此相似。

糖尿病患者由于长期代谢异常和高血糖状态，往往会伴有多种并发症，其中也会使肠道内微生态受到严重影响[36,37]。不过，也有研究证明，肠道菌群失调也是引起糖尿病的一个重要原因[38,39]。在肠道内菌群失调时，肠道内益生菌如双歧杆菌数量减少，而一些有害菌如大肠杆菌和梭菌的数量上升，使体内尿碱合成受阻，因此游离氨数量增加，促使肠道内pH升高，使更多有害菌大量繁殖[40-42]。而花椒精油可显著降低盲肠总质量、盲肠壁质量和盲肠内容物游离氨的含量(表4)，均有降低盲肠内容物pH值和盲肠表面积的趋势(表4)。说明，花椒精油可以改善因STZ诱导的盲肠组织肿大，减少游离氨等对肠道上皮伤害，具有维持因STZ诱导的1型糖尿病小鼠肠道健康的作用。

肠道内厌氧菌的数量和代谢情况可以通过短链脂肪酸(SCFA)的组成和总量来间接体现[43,44]。与空白组相比，模型组盲肠内容物中丙酸、丁酸、戊酸和SCFA均显著(P<0.05)降低(表5)；这与以往的研究相一致[46,47]。研究表明，糖尿病会导致短链脂肪酸含量下降，原因可能是因为糖尿病导致肠道菌群稳态失调，导致致病菌生长，抑制有益菌生长，降低肠道内的发酵反应，减少短链脂肪酸的生成[48,49]。而给予花椒精油灌胃28 d后，可显著(P<0.05)增加小鼠盲肠内容物中丙酸、丁酸、戊酸和SCFA的量(表5)。表明花椒精油具有增加肠道内的发酵反应，提高短链脂肪酸含量，改善因糖尿病导致小鼠肠道菌群稳态失调的作用。而陈康等[50]发现，长链菊粉可通过改善肠道微生物的稳态来缓解1型糖尿病小鼠的炎症状况和发病进程。推测，花椒精油对1型糖尿病小鼠血糖代谢的影响与其改善肠道微生物的稳态、减少炎症和氧化应激有关，其具体作用机制有待进一步研究。

周兴婷等[49]研究表明，Lactobacillus 和 Ruminococcus 与短链脂肪酸的生成呈正相关性，且与乙酸、丁酸和丙酸的生成呈正相关性，而 Akkermansia 和Bifidobacterium 与丁酸的生成呈正相关性。Ruminococcus[51]是公认的产丁酸的菌，肠道丁酸的减少会促进炎症反应，进而破坏正常的肠道屏障功能，糖尿病会使机体肠道产丁酸菌的丰度的显著下降。实验结果表明，采STZ诱导的糖尿病小鼠盲肠内容物中乳酸杆菌、双歧杆菌和梭菌均显著(P<0.05)降低，显著增加肠杆菌和肠球菌的量(表6)，这与以往的研究结果相一致。而花椒精油可显著增加乳酸杆菌和双歧杆菌的量，可降低肠杆菌和肠球菌的量。以上结果表明，花椒精油可增加糖尿病小鼠盲肠内容物丁酸、丙酸和戊酸的含量，改善肠道菌群的丰度，增加有益菌乳酸杆菌和双歧杆菌的量，减少致病菌低肠杆菌和肠球菌的量，在一定程度上缓解了STZ诱导的1型糖尿病的肠道失调。