臭氧水协同超声波处理对小麦中DON降解效果的研究

杨 龙 关二旗 杨玉玲 李萌萌 卞 科

(河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001)

小麦赤霉病是一种由多种镰刀菌引起的世界性流行病害，多发于气候温润多雨的温带地区，在我国流行区域主要集中在东北春麦区和长江中下游冬麦区[1]。小麦扬花期时多为温暖多雨天气，为赤霉病病菌侵染提供了有利环境条件，使我国成为世界上麦类赤霉病发生频率最高、受影响最大的国家之一[2]。赤霉病不仅造成小麦产量损失和品质的下降，更为重要的是严重影响食品安全，对人畜有较大的危害[3, 4]。因此，设法降解赤霉病小麦中的真菌毒素，在保障消费者健康、减少经济损失、加快该产业的健康快速发展等方面具有重大的经济意义和社会意义[5]。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等真菌侵染谷物后所产生的次级代谢产物，是赤霉病小麦中最主要的真菌毒素，DON具有很强毒性，人误食含有呕吐毒素的食物后，常会引起四肢无力、头昏、发热、腹胀、腹泻和呕吐等症状，动物对呕吐毒素具有一定的敏感性。严重影响人畜健康[6, 7]。随着赤霉病在世界范围内的蔓延，国内外学者对DON的削减方法进行了大量的研究和探索。目前，关于DON的削减技术主要集中在物理法、化学和生物方法上，其中物理方法主要包括小麦加工(清洗、分选、研磨[8, 9])、热处理(过热蒸汽[10]、焙烤[11])、辐照(紫外光[12]、60Co-γ射线[13]和微波诱导[14])和吸附[15]等；化学方法包括SO2[16]和Na2CO3[17, 18]等；生物法包括利用酶(呕吐毒素糖基化酶[19]等)、微生物(米曲霉[20]、乳酸菌[21]、放线菌[22]、肠杆菌[23]等)将毒素代谢为无毒产物等。无论物理方法、化学方法还是微生物方法均存在一定的缺陷，如物理方法脱毒效果差、影响小麦品质等；化学方法可能有化学物质的残留或产生新的有毒物质；生物法工艺难度大、见效周期较长、经济成本过高、可能产生有害物质等，因此寻找更为安全有效的DON降解方法迫在眉睫。为解决现有技术手段存在的问题，目前大量研究纷纷转向两项或多项技术的联合处理，提高有机物的降解率[24]。

臭氧(O3)因其具有极强的氧化性，而且无毒性残留，已被普遍认为是一种安全、可直接应用于食品加工的处理手段[10]。近年来，国内外研究者就臭氧气体[25, 26]或臭氧水[27]对小麦籽粒和全麦粉中DON降解效果进行大量研究，但单独臭氧处理存在臭氧浓度过高、费用高、矿化程度低和利用率低等缺点，因此有研究者将其与其他技术联合使用，以获取更好的降解效果和经济效益。超声波具有特殊的物理化学效应，特别是超声空化所产生的高温、高压，为有机物的化学反应提供了极端的物理化学环境[28]。超声波技术具有操作和控制容易，在处理中不引入其他的化学物质，且反应条件温和、反应速度快等优点，应用前景广阔[29]。有研究者将超声波技术与臭氧结合，进行食品保加工[30, 31]、污水处理[32, 33]、农残降解[34]等处理。但是，采用臭氧水协同超声波联合降解DON的研究却鲜有报道。因此，本研究采用臭氧水协同超声波处理赤霉病小麦，探究不同协同处理方式对DON降解的规律，并确定臭氧水协同超声波处理赤霉病小麦籽粒降解DON 的最佳工艺条件，为臭氧水协同超声波处理在DON降解中的应用提供更多理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霉病小麦：河南省南阳市；DON 纯品(纯度≥99%)、乙腈(色谱级)、乙腈(分析级)、甲醇(色谱级)、甲醇(分析级)、超纯水。

1.2 仪器与设备

SFX 20:0.55超声波破碎仪，COM-AD-01高浓度臭氧发生仪，JSA9-O3-UV便携式紫外臭氧检测仪，SFX 20:0.55超声波细胞破碎仪,Waters e2695液相色谱仪,12165001B BEM多功能净化柱,Centrifuge 5810R高速离心机,MTN-2800D氮吹浓缩仪。

1.3 实验方法

1.3.1 臭氧水的制备

打开臭氧发生器，待设备稳定后，开启氧气罐阀门，制备的臭氧通过鼓泡法直接通入常温的超纯水中获得臭氧水，通过控制通气时间和气体流量获得不同浓度的臭氧水。臭氧水浓度的测定参考郝淑贤等[35]的方法。

1.3.2 不同联合处理方式对小麦中DON的降解效果影响

将25 g经清理除杂的小麦样品置于400 mL烧杯中，处理总时间为10 min。在臭氧水浓度为58.32 mg/L、超声振幅为50%条件下，研究臭氧水和超声波联合处理的方式，分别采用单一、串联、先单一后并联、先并联后单一和并联的方式研究对小麦中DON的降解效果，确定最佳处理方式。如表1所示，小麦籽粒具体处理方法如下：T1，未进行任何处理的赤霉病小麦籽粒；T2，单一处理实验，超声波(超纯水)处理10 min；T3，单一处理实验，臭氧水浸泡处理10 min；T4，串联实验，先臭氧水后浸泡5 min，后超声波(超纯水)处理5 min；T5，串联实验，先超声波(超纯水)处理5 min，后臭氧水后浸泡5 min；T6，先臭氧水后浸泡5 min，后超声波(臭氧水)处理5 min；T7，先超声波(臭氧水)处理5 min，后臭氧水后浸泡5 min；T8，联合处理，臭氧水浸泡与超声波处理同时进行10 min。每个处理进行三组平行实验。

表1 不同臭氧水和超声波联合处理方式的设置

1.3.3 臭氧水协同超声波处理对小麦中DON的降解效果影响

处理方式确定后，分别研究臭氧水浓度、超声振幅和处理时间比(超声波处理时间与臭氧水处理时间的比值)三个因素对小麦中DON降解效果的影响。每个处理设置三个平行。

1.3.3.1 不同臭氧水浓度小麦中DON的降解效果影响

将25 g经清理除杂的小麦样品置于400 mL烧杯中，处理总时间为10 min，在超声振幅为50%、处理时间比为5∶5条件下，先加入75 mL超纯水后超声波处理5 min，倒尽水后再加入75 mL臭氧水浸泡5 min，臭氧水浓度分别为14.58、29.16、43.74、58.32 mg/L，对照组未经任何处理。处理完后，将小麦籽粒放入40 ℃烘箱中烘干，4 ℃下储存备用。烘干后小麦水分含量测定参照GB/T 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。

1.3.3.2 超声振幅对小麦中DON的降解效果影响

将25 g经清理除杂的小麦样品置于400 mL烧杯中，处理总时间为10 min，在臭氧水浓度为58.32 mg/L、处理时间比为5∶5条件下，先加入75 mL超纯水后超声波处理5 min，倒尽水后再加入75 mL臭氧水浸泡5 min，超声振幅分别设定为10%、30%、50%、70%，对照组未经任何处理，其余步骤同上。

1.3.3.3 处理时间比对小麦中DON的降解效果影响

将25 g经清理除杂的小麦样品置于400 mL烧杯中，处理总时间为10 min，在超声振幅为50%、臭氧水浓度为58.32 mg/L条件下，先加入75 mL超纯水后进行超声波处理，倒尽水后再加入75 mL臭氧水进行浸泡处理，处理时间比分别设定为1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1，对照组未经任何处理，其余步骤同上。

1.3.4 正交优化降解小麦中DON工艺参数

在以上单因素实验的基础上，进行正交实验，选择L9(34)正交表对臭氧水浓度、超声振幅和处理时间比3个因素进行优化，以确定DON降解的最佳条件，因素与水平表见表2。

表2 正交实验因素与水平设计表

1.3.5 DON的测定

DON的提取、净化参照Liu Yuanxiao等[10]的方法。利用高效液相色谱法对 DON进行定量检测，检测方法参考Li Mengmeng等[36]的研究。

DON降解率的计算：

DON降解率=(1-CA/C0)×100%

式中：CA为小麦样品经不同方式处理后DON的浓度/mg/kg；C0为小麦样品中DON的初始浓度/mg/kg。

1.4 数据统计与分析

每个实验指标重复测定三次，测定的数据通过Excel 2010处理，并用SPSS 20进行显著性(P<0.05)分析。

2 结果与分析

2.1 DON标准曲线的绘制

由图1可知，DON标准溶液在0.1～10 μg/mL浓度范围内，DON质量浓度与色谱峰面积呈现良好的线性关系，方程表达式为y=1.84×104x-2.69×102，相关系数R2为0.999 9，表明该标准曲线能够对待测样品中DON含量进行准确定量。

图1 DON溶液标准曲线

2.2 不同臭氧水和超声波联合处理方式对小麦中DON降解效果的影响

在相同的臭氧水浓度和超声振幅下(58.32mg/L，50%)，研究不同的处理方式对小麦中DON降解效果，分别采用了单一、串联、并联以及混合联合的方式处理小麦，总处理时间为10 min，结果见表3。

表3 不同臭氧水和超声波联合处理方式对小麦中DON降解效果的影响

比较表3中的处理方式可知，当采用T6(先臭氧水处理5 min再联合处理5 min)DON降解效果最差，降解率显著低于其他处理方式(P<0.05)；并联方式T8(超声波和臭氧水协同处理10 min)DON降解率与单一方式T3(臭氧水处理10 min)无显著性差异(P>0.05)。这可能是因为超声波促进臭氧分解产生更多·OH自由基，同时也会加快臭氧水中臭氧分子的溢出，导致对DON的降解效果并不明显[34]。同样是串联处理方式，T4(先臭氧水处理5 min后再超声波处理5 min)的DON降解率显著降低T5处理(P<0.05)，这可能是因为先超声波处理时，超声波的空化作用破环细胞组织，产生局部破碎，加快分子扩散，有利于DON的溶出，为后续臭氧水处理时，臭氧分子和·OH自由基更易接触到DON[28, 31]。当采用T7(先超声波和臭水同时处理5 min，后臭氧水处理5 min)DON降解效果最好，DON含量由2.075 mg/kg降至1.070 mg/kg，降解率为48.43%，这可能与超声作用加速臭氧溶解，使之产生的自由基与DON更好的接触并将其氧化分解有关[28]。与此同时，以T5(先超声波处理5 min后再臭氧水处理5 min)串联方式处理小麦时，DON降解率为46.99%，降解效果与T7处理效果无显著差异(P>0.05)，因此选择T5处理进行下一步的单因素实验。

2.3 不同臭氧水浓度对小麦中DON降解效果的影响

前期对不同单一和联合处理方式对DON的降解效果进行比较分析，确定T5(先超声波处理5 min，再臭氧水处理5 min)为最佳联合处理方式，在此基础上，改变臭氧水浓度(超声波振幅为50%，处理时间共10 min)，对小麦中DON降解效果进行研究，结果如表4所示。研究表明，不同浓度臭氧水处理小麦籽粒5 min后，其DON有明显的降解效果。随着臭氧水浓度的增大，小麦中DON含量显著降低(P<0.05)。当臭氧水浓度为58.32 mg/L时，DON含量降至1.228mg/kg，降解率高达到41.55%。提高臭氧水质量浓度，DON 与臭氧分子接触机会越大，生成的·OH自由基也越多，间接氧化作用越显著，因而降解作用越强[37]。

表4 不同臭氧水浓度对小麦中DON降解效果的影响

2.4 超声振幅对小麦中DON降解效果的影响

在确定T5(先超声波处理5 min后再臭氧水处理5 min)为最佳联合处理方式的基础上，改变超声振幅(臭氧水浓度为58.32 mg/L，处理时间共10 min)，对小麦中DON降解效果进行研究。结果表明，超声波振幅不同，小麦中DON有明显不同的降解效果(表5)。随着超声波振幅的增大，DON含量逐渐降低，降解率逐渐升高。当超声波振幅为70%时，DON含量降至1.145 mg/kg，降解率达到45.47%。这可能是因为超声波振幅与空化泡崩溃产生的温度和压力有关，振幅增大，导致空化泡更为剧烈地崩溃，从而产生更高的温度和压力，同时也增大了羟基等自由基的浓度，使DON削减率提高[38]。

表5 超声振幅对小麦中DON降解效果的影响

2.5 处理时间比对小麦中DON降解效果的影响

在确定T5(先超声波处理5 min后再臭氧水处理5 min)为最佳联合处理方式的基础上，改变超声波和臭氧水的处理时间比(超声波振幅为50%、臭氧水浓度为58.32 mg/L)，对小麦中DON降解效果进行研究。由表6可知，随着超声波处理时间的延长和臭氧水处理时间的缩短，DON含量整体呈降低趋势，降解率整体呈升高趋势。当先超声波处理9 min再臭氧水处理1 min时，小麦中DON含量降至1.198 mg/kg，降解率达到45.07%。这是因为随着超声波处理时间延长，空化泡数量逐渐增多，空化泡崩溃产生的高温高压和强氧化性自由基有利于DON的降解；此外，超声波处理时间延长，会促使溶液温度升高，导致水的蒸汽压升高，表面张力和粘滞系数降低，从而更有利于空化泡的产生，提高DON的削减率[39]。

表6 处理时间比对小麦中DON降解效果的影响

2.6 正交实验结果与分析

对臭氧水浓度、超声振幅和处理时间比进行正交实验，以确定DON降解的最佳条件(表7)。研究表明，对小麦中DON降解率影响因素次序为C>A>B，即对小麦中DON降解率影响最大的因素是处理时间比，其次是臭氧水浓度和超声振幅。因此，通过正交实验优化臭氧水协同超声波降解小麦中DON工艺条件，最优工艺条件为A3B2C3，即臭氧水浓度为58.32 mg/L，超声振幅为60%，处理时间比为9∶1，此条件下DON降解率最高，为50.84%。

表7 正交实验结果

3 结论

超声波和臭氧水不同联合处理方式对赤霉病小麦中DON有不同的降解效果。本实验分别采用单一、串联、先单一后并联、先并联后单一和并联的方式来研究臭氧水协同超声波联合处理方式对小麦中DON的降解效果。综合考虑，确定了最佳处理方式为串联T5，即先超声波处理5 min再臭氧水处理5 min，此时赤霉病小麦中DON降解率最高，为46.99%。T5处理方式比之单一超声波和单一臭氧水处理对赤霉病小麦中DON降解效果更佳，降解率分别提升约46.07%和28.84%。

在T5串联处理方式下探讨臭氧水浓度、超声振幅和处理时间比对DON降解效果的影响。研究表明，臭氧水浓度、超声振幅增大，超声波处理时间的延长，均会导致DON降解率的显著升高，三者对小麦中DON降解率影响因素次序为：处理时间比>臭氧水浓度>超声振幅，DON降解最优工艺条件为：臭氧水浓度为58.32 mg/L，超声振幅为60%，处理时间比为9∶1，DON降解率最高为50.84%。