2株胶东地区Ⅰ群禽腺病毒分离株的致病性试验

董振杰 , 刘 东 , 魏建平 , 佘锐萍

[1.福喜(威海)农牧发展有限公司 , 山东 威海 452600 ； 2.青岛易邦生物工程有限公司，山东 青岛 266000 ； 3.大连成三牧业股份有限公司，辽宁 大连 116300 ； 4.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193]

Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，有12个血清型，其中FAdV-8b血清型可引起鸡包涵体肝炎(IBH)， FAdV-4血清型可引起鸡心包积水综合征(HHS)[1]。近年来，这2种疾病在世界各地(例如美国[2]、韩国[3]、日本[4]和中国[5])均有暴发，已经对肉鸡和肉种鸡的养殖造成了较严重的经济损失。2013年，胶东地区发现了1例包涵体肝炎的病例，导致10～15日龄商品代雏鸡出现死亡，死亡率约为2%～10%；2015年，胶东地区发现了1例鸡心包积水综合征的病例，导致31周龄的肉种鸡出现死亡，死亡率为14.05%。采集上述2个病例的肝脏样品进行病毒分离鉴定，发现病原分别为FAdV-8b和FAdV-4，分别命名为FXWH-8b株和FXWH-4株。

以2株分离株为研究对象，通过对15日龄SPF鸡进行攻毒试验，对病毒的毒力和致病性进行研究，旨在明确FXWH-8b株和FXWH-4株感染发病后的临床症状、剖检病变、病理组织学变化及病毒在各组织器官的分布情况，为阐明FXWH-8b株和FXWH-4株的致病机理及防制提供理论依据。

1 材料

15日龄SPF鸡，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；稀释复壮后(TCID50108.0)FXWH-8b株和FXWH-4株的病毒液各10 mL，来自青岛易邦生物工程有限公司；TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)、蛋白酶K，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醛、梯度乙醇和二甲苯(级别为化学纯)、伊红染液、苏木素染色液，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；FAdV单抗(3D7)，购自国家兽用药品工程技术研究中心。

2 方法

2.1 攻毒试验 60只15日龄的SPF雏鸡随机分成3组，每组20只。分别为FXWH-8b株攻毒组、FXWH-4株攻毒组、空白对照组。通过腿部肌肉注射接种，攻毒组病毒注射剂量均为0.2 mL/只，对照组每只注射0.2 mL生理盐水。各组鸡只分别饲养在不同的隔离器中，逐日观察症状并记录，观察期为3 d。观察完成后，所有鸡只安乐死。

对各组鸡只进行剖检观察，并做好记录，采取各组鸡只的脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、十二指肠、空肠、盲肠、法氏囊、腺胃、胰腺、胸腺、气管等组织，冻存，作为PCR检测的样品；另取各组3～4只发病的活鸡和死鸡的上述组织，用10%的中性甲醛溶液固定24 h。

2.2 病理组织学观察 采用常规石蜡切片的方法制作切片，通过苏木精-伊红(H.E.)染色，中性树胶封片，在光学显微镜下观察病变并记录。

2.3 PCR检测 用Meulemans G发表的通用引物，检测病毒在各组织中的分布情况。

2.4 免疫组化分析 用常规免疫组化方法进行试验，在普通光学显微镜下观察结果。

3 结果

3.1 临床症状 FXWH-8b株攻毒组：攻毒24 h后，有5只鸡开始出现明显的临床症状，表现精神沉郁，羽毛蓬松，采食量下降，头部皮肤及眼部发绀，排出黄绿色稀粪，畏寒怕冷，对外界刺激反应迟钝甚至无反应；72 h后，有8只鸡死亡，剩余的12只鸡均出现明显临床症状。FXWH-4株攻毒组：攻毒24 h 后，有12只鸡开始出现明显临床症状，表现精神沉郁，羽毛蓬松，采食量下降，头及眼部发绀，排出黄绿色稀粪，畏寒怕冷，对外界刺激反应迟钝甚至无反应；48 h后20只鸡全部死亡。对照组：在72 h 内无任何明显临床症状。

3.2 剖检变化 FXWH-8b株和FXWH-4株攻毒后剖检病理变化见表1。

表1 分离株攻毒后剖检病理变化Table 1 Pathological changes of the isolates after virus challenge

3.3 病理组织学观察 FXWH-8b株攻毒72 h后，死鸡和活鸡病理组织学观察均显示肝脏细胞呈弥散性脂肪变性(见中插彩版图1)，可见灶性坏死，核内包涵体不明确；脾脏髓窦内含铁血黄素沉淀；肺脏严重淤血；肾脏出血，肾小管上皮细胞脱落；十二指肠黏膜上皮细胞轻微脱落；空肠黏膜上皮细胞轻微脱落；盲肠黏膜上皮细胞轻微脱落；腺胃黏膜上皮细胞轻微脱落；法氏囊淋巴滤泡内少量淋巴细胞遗失。

FXWH-4株攻毒48 h后，死鸡的病理组织学观察结果显示，肝脏病变同上(见中插彩版图1)；脾脏白髓淋巴滤泡内淋巴细胞遗失；肺脏严重淤血；肾脏肾小管上皮细胞脱落；十二指肠黏膜上皮细胞脱落；空肠黏膜上皮细胞脱落；盲肠、腺胃黏膜上皮细胞坏死，固有层淤血；法氏囊黏膜上皮细胞严重脱落、淋巴滤泡内淋巴细胞遗失。

空白对照组注射生理盐水72 h后，活鸡病理组织学观察结果显示，在肝脏、肺脏、腺胃和盲肠有轻微的组织病理学变化。

3.3 PCR检测 FXWH-8b株和FXWH-4株攻毒组SPF鸡的脑、胸腺、气管、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠和法氏囊组织样品中，病毒PCR检测均呈阳性；其中，在鸡的肝脏、肺脏、肾脏、腺胃、空肠和盲肠样品中的PCR检测阳性率均为100%。结果见表2。

3.4 免疫组化分析 FXWH-8b株病毒抗原仅在肝脏组织样品中检测呈阳性；FXWH-4株病毒抗原在肝脏、肾脏、十二指肠和空肠组织样品中检测均呈阳性，阳性信号强度是：肝脏>十二指肠>空肠和肾脏。对照组样品检测均呈阴性。结果见表3、中插彩版图2。

表2 组织中的病毒DNA PCR检测结果Table 2 PCR results of virus DNA in tissues (只)

表3 免疫组化染色结果Table 3 Immunohistochemical staining results

4 讨论

临床症状观察显示，FXWH-8b株和FXWH-4株均能在攻毒后48 h内引起15日龄的SPF试验鸡发病，呈现较明显的临床症状。FXWH-8b株攻毒后48 h没有鸡只死亡，72 h时引起40%的试验鸡死亡；FXWH-4株在48 h引起100%的试验鸡死亡。这可能是由于病毒以注射方式感染时，毒株会表现很强的致病性，短时间内造成机体损伤乃至死亡，呈现急性感染死亡的症状[1]；另一个原因可能是攻毒剂量过大，故建议其他研究者将感染途径改为以滴口方式通过消化道感染，攻毒剂量应多次预试验后确定。从死亡率来看，2株分离株的毒力都比较强，但是FXWH-4株的毒力远强于FXWH-8b株，这与刘东等[7]研究认为血清型FAdV-4毒力较强，本身能引起易感鸡群的发病的结论一致。

病理组织观察结果显示，在2株Ⅰ群禽腺病毒分离株攻毒后鸡的组织切片中，均未观察到核内包涵体的存在，其原因可能是由于FXWH-4株在攻毒后48 h鸡只全部死亡，FXWH-8b株攻毒后72 h活鸡均已安乐死处理，导致病毒没有充足的时间作用于活体细胞，因而未形成核内包涵体。这与国纪垒等[8]报道的血清10型腺病毒在人工感染SPF鸡只第5天在肝脏内出现少量嗜碱性的核内包涵体一致。该结果表明以后关于Ⅰ群禽腺病毒的核内包涵体的研究至少需要观察到攻毒后5 d。

病毒分布检测结果显示，2株分离株无论是在死鸡还是活鸡的肝脏、肺脏、肾脏、腺胃、空肠和盲肠样品中检出率均为100%，说明2株分离株在攻毒后均较快在多组织器官定植，这些器官均是2株毒株的靶器官。此试验结果与赵静研究的包涵体肝炎在肝脏和盲肠的检出率较高是一致的。与国纪垒等[8]研究的血清10型感染1日龄SPF鸡的结果：肝脏、脾脏和肠道是病毒侵害的主要靶器官是一致的。故这些器官可以作为此病毒分离鉴定的采样器官。

免疫组化试验结果显示，分离株病毒抗原广泛存在于肝脏细胞中，与赵静等[9]研究结果一致，但FXWH-4株在肾脏、十二指肠和空肠组织内也有病毒抗原存在，说明不同的病毒株有不同的嗜组织性。

综上所述，2株胶东地区Ⅰ群禽腺病毒分离株FXWH-8b株和FXWH-4株均有较强的毒力和致病性，可侵害多个鸡只组织和器官。