青岛地区牛源产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌流行性分析

芦天文，刘宝涛，张启迪，刘焕奇，邹 明

(青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109)

大肠杆菌感染被认为是奶牛乳房炎和犊牛腹泻的重要原因之一[1]，给养殖业带来了不可估计的损失。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)可以水解青霉素和第3代头孢菌素(3GCs)的β-内酰胺类化合物，它们主要存在于肠杆菌科中[2]。

blaCTX-M是ESBLs的主要流行基因型，1989年在德国首次报道后流行率逐渐提高[3]。携带blaCTX-M大肠杆菌在动物(家畜和宠物)的广泛传播已经成为了一个全球性的卫生问题，产ESBLs大肠杆菌可能通过食物链转移给人。CTX-M-1 group被发现是动物源大肠杆菌的主要流行亚型[4]，其次是CTX-M-9 group。[3]

家禽和猪的产ESBLs的大肠杆菌报道较多且流行率较高，然而牛源产ESBLs大肠杆菌尤其是牛场环境样品的报道很少，本试验通过对山东青岛地区22个奶牛场分离到的782株牛源大肠杆菌筛选了blaCTX-M超广谱β-内酰胺酶基因，并测定了最小抑菌浓度(MIC)，旨在了解青岛地区blaCTX-M耐药基因的流行情况和耐药情况，为临床使用头孢菌素类药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品 对山东省青岛地区22个奶牛场进行样品采集，分别采取牛奶877份、粪便样品477份、饮水样品54份、污水样品60份及土壤样品91份，共1 616份样品。

1.2 试剂及药品 麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、LB肉汤、MH肉汤和MH琼脂，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Taq酶、Marker 2 000， 均购自TaKaRa试剂公司。

1.3 方法

1.3.1 增菌培养 将牛奶样品6 000 r/min离心5 min 后弃上清，加入LB肉汤混匀，37 ℃培养18～20 h。将粪便样品在含有生理盐水的离心管混匀后吸出100 μL加入LB肉汤中混匀，37 ℃培养18～20 h。 将饮水和污水样品吸取100 μL加入到LB肉汤中混匀，37 ℃培养18～20 h。将土壤样品加入一定量的LB肉汤中混匀，吸取100 μL加入到LB肉汤中混匀，37 ℃培养18～20 h。

1.3.2 大肠杆菌的分离 菌液在麦康凯培养基上划线接种，37 ℃培养18～24 h后观察菌落形态特征。

1.3.3 大肠杆菌的纯化 将疑似大肠杆菌菌落接种在伊红美蓝平板上培养观察菌落形态特征。

1.3.4 DNA模板的制备 采用煮沸法提取细菌DNA模板。

1.3.5 耐药基因blaCTX-M的扩增 参考文献[5]检测超广谱β-内酰胺酶耐药基因blaCTX-M-1G、blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G、blaCTX-M-9G、blaCTX-M-25G,使用25 μL PCR体系扩增，经1%琼脂糖电泳后经凝胶成像系统检测条带，测序。

1.3.7 ESBLs确证试验 对阳性大肠杆菌采用美国临床和试验室标准协会(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐纸片扩散法进行ESBLs的表型确证试验，头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸双纸片，若抑菌环直径之差≥5 mm，即判定为ESBLs阳性菌株。

1.3.8 药敏试验 大肠杆菌菌ATCC 25922作为药敏试验的质控菌株。对PCR扩增得到的阳性大肠杆菌，根据CLSI标准采用琼脂稀释法对庆大霉素、萘啶酸、多西环素、恩诺沙星、头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、四环素、链霉素、头孢呋辛、氨苄青霉素、头孢噻呋、卡那霉素、氟苯尼考、阿米卡星、美罗培南、磷霉素共17种抗生素进行药敏试验，获得其最小抑菌浓度(MIC)值，用肉汤稀释法对多黏菌素、替加环素测定敏感度，判断药物的敏感性。

2 结果

2.1 细菌的分离纯化 青岛地区22个奶牛场共分离到疑似大肠杆菌782株，其中牛奶源203株，分离率23.1%(203/877)；粪源477株，分离率100%(477/477)；饮水源19株，分离率35.1%(19/54)；污水源51株，分离率85%(51/60)；土壤源32株，分离率35.1%(32/91)。

2.2 PCR扩增 经PCR鉴定，共扩增到疑似blaCTX-M-1G目的条带菌株27株，疑似blaCTX-M-9G目的条带菌株16株，未检测到blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G、blaCTX-M-25G疑似条带(共42株阳性大肠杆菌，其中1株大肠杆菌同时含有blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G)，挑选PCR产物测序BLAST比对，相似度高于99%确定为目的条带。

2.3 ESBLs确证试验 用双纸片协同试验确证42株大肠杆菌均产ESBLs。42株产ESBLs大肠杆菌中16株来源于牛奶源大肠杆菌、16株来源于粪源大肠杆菌、1株来源于饮水源大肠杆菌、7株来源于污水源大肠杆菌、2株来源于土壤源大肠杆菌。牛源大肠杆菌blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G检出率统计见表1。各牛场牛源大肠杆菌blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G检出率统计见表2和表3。

表1 牛源大肠杆菌blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G检出率Table 1 Detection rates of blaCTX-M-1G and blaCTX-M-9G from bovine Escherichia coli

表2 22个奶牛场的blaCTX-M-1G检出率Table 2 Detection rate of blaCTX-M-1G in 22 dairy farms %(blaCTX-M-1G阳性大肠杆菌数/大肠杆菌数) % (blaCTX-M-1G positive E. coli / E. coli)

表3 22个奶牛场的blaCTX-M-9G检出率Table 3 Detection rate of blaCTX-M-9G in 22 dairy farms %(blaCTX-M-1G阳性大肠杆菌数/大肠杆菌数) % (blaCTX-M-1G positive E. coli / E. coli)

2.4 药敏试验 42株产ESBLs大肠杆菌对头孢噻肟、头孢噻呋、头孢呋辛和氨苄西林均耐药；对替加环素、阿米卡星和美罗培南均敏感；对氟喹诺酮类药物环丙沙星(7.1%)、左氧氟沙星(7.1%)、萘啶酸(28.5%)和恩诺沙星(9.5%)均有一定的耐受性；对氨基糖苷类药物庆大霉素和卡那霉素耐受性较低，为2.3%和7.1%；链霉素较高，为26.1%；四环素类药物四环素为35.7%、多西环素为28.5%；多磷类抗生素磷霉素为7.1%；多肽类抗生素多黏菌素较高，为47.6%；兽医专用酰胺醇类药物氟苯尼考耐受性为16.6%。多重耐药主要是以2耐、3耐为主，分别占到38.0%和26.2%，3耐及3耐以上占到47.4%，有4株耐6类抗生素。见表4、表5。

表4 42株产ESBLs大肠杆菌的多重耐药统计Table 4 Multi-drug resistance statistics of 42 ESBLs-producing Escherichia coli

表5 42株产ESBLs大肠杆菌药敏试验结果Table 5 Drug susceptibility test results of 42 ESBLs-producing Escherichia coli

3 讨论

3.1 牛源大肠杆菌的分离率分析 本试验对青岛地区22个奶牛场采集的1 616份样品，共分离到782株大肠杆菌，其中牛奶样品分离率23.1%(203/877)，高于Yang等[6]分离率11.1%。环境样品(饮水、污水和土壤)分离率49.7%，明显高于郭春燕[7]15%～23%，主要是由于本试验采集了污水样品。大肠杆菌的分离率较高，表明部分奶牛场存在较为严重的大肠杆菌污染情况，牛场的管理人员应加强管理，增强管理人员和一线工人的操作规范，减少细菌的滋生和污染风险。

3.2 大肠杆菌blaCTX-M检出率分析 筛选了β-内酰胺酶耐药基因blaCTX-M, 未检测到blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G、blaCTX-M-25G耐药基因，结果显示，其他3种亚型未在青岛地区牛场广泛传播。

携带blaCTX-M-1G大肠杆菌分离率为3.5%，与方光远等[8]牛源大肠杆菌检出率3.7%结果相近，相比较检出率明显低于郭翠平等[9]山东省禽源检出率28%。本试验分离到1株饮水源和6株污水源大肠杆菌携带blaCTX-M-1G基因，其中有4株污水源来源于场11和场13，由表2可以看出，场11和场13肛门拭子大肠杆菌中有着较高的blaCTX-M-1G基因检出率；另1株饮水源和2株污水源来源于场12和场20，我们发现在这两家奶牛场的牛奶样品和肛门拭子样品中均未检出到blaCTX-M-1G基因。

携带blaCTX-M-9G基因大肠杆菌分离率为2.0%，检出率低于郭翠平等[9]山东省禽源检出率37.3%，杨守深等[10]猪源检出率17.4%。牛奶中大肠杆菌的检出率(4.4%)明显要高于粪便样品(0.6%)。1株污水源和2株土壤源大肠杆菌中检出到blaCTX-M-9G基因，除1株污水源来源于检出率较高的场11，另1株污水源大肠杆菌和1株土壤源大肠杆菌来源于场5和场20，此两场其他样品均未检测到blaCTX-M-9G基因。

3.3 产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的耐药性分析 使用琼脂稀释法对42株携带blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G基因的大肠杆菌，测定19种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。42株大肠杆菌对头孢噻肟、头孢噻呋、头孢呋辛和氨苄青霉素均耐药，与Yang等[6]的结果一致；对美罗培南耐药率0%，与Yang等[6]结果一致。氟喹诺酮类药物环丙沙星(7.1%)、左氧氟沙星(7.1%)均低于Yang等[6]的结果，而萘啶酸(28.5%)略高，恩诺沙星(9.5%)与南海辰等[11]结果一致。对氨基糖苷类药物庆大霉素和卡那霉素耐受性较低，为2.3%和7.1%，链霉素较高，为26.1%，远远低于Yang等[6](70%～80%)的结果。据报道，近期有携带ESBLs的质粒同时携带氟喹诺酮、氨基糖苷等耐药基因广泛传播，可能是这两类抗生素耐受性差距较大的原因，表明此类质粒未在青岛地区广泛传播。

四环素类药物四环素(35.7%)和多西环素(28.5%)有着较高的耐受性可能与牛场有四环素药物的用药史有关，替加环素作为一种新的四环素抗生素,可用于产ESBLs的革兰阴性菌，此次试验菌株耐受率为0%。多磷类抗生素磷霉素7.1%低于李明举等[12]29.2%。多黏菌素47.6%低于刘华栋等[13]64.7%，主要是多黏菌素以前被用作促生长剂在兽医临床上使用。兽医专用的酰胺醇类药物氟苯尼考16.6%和轩慧勇等[14](16.7%)结果一致。

家禽和猪源的携带blaCTX-M基因大肠杆菌具有很高的流行率，然而牛源的数据却低得多。环境可能是细菌水平传播的中介，但是对于牛场的环境数据并不多，本试验在牛场的饮水、污水和土壤中都分离到了不同数量携带blaCTX-M-1G或blaCTX-M-9G基因的大肠杆菌，为耐药菌的水平传播方式提供了数据支撑，为牛场用药提供了理论指导。