冠状病毒疫苗的研究进展

崔文禹，徐静

国药中生生物技术研究院有限公司，北京 101111

冠状病毒是一组有包膜的单链RNA 病毒，在系统分类中属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)[1]。冠状病毒直径约80～120 nm，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(A)尾，基因组全长约27～32 kb，是已知RNA病毒中基因组最大的病毒。根据血清学和基因组特点，冠状病毒科被分为4 个属(α、β、γ和δ)，其中只有α和β属含有对人致病的毒株。严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种可感染人类的冠状病毒分别是人冠状病毒229E(human coronavirus 229E, HCoV-229E)、人冠状病毒OC43 (human coronavirus OC43, HCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)、人冠状病毒NL63 (human coronavirus NL63, HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1 (human coronavirus HKU1, HCoV-HKU1)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)。其中4种流行的“普通”人冠状病毒，即HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1，主要引起轻度自限性上呼吸道疾病[2]。而SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2属于高致病性冠状病毒，可引起严重的呼吸系统疾病，致死率高，对人类健康构成严重威胁。由于目前对该类高致病性病毒引起的感染无特异性预防措施和治疗方法，因此研制高致病性冠状病毒疫苗具有重要的意义。

随着SARS-CoV-2感染人数不断攀升，研制针对该病毒的有效疫苗成为近期的研究热点。本文以高致病性冠状病毒疫苗(包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗和核酸疫苗)的研究展开综述。

1 冠状病毒的生物学性状

冠状病毒基因组序列比对显示，整个基因组的同源性为54%，其中非结构蛋白编码区同源性为58%，结构蛋白编码区同源性为43%，这表明非结构蛋白基因保守，而结构蛋白基因呈多样化[3]。SARS-CoV-2基因组(GenBank:MN975262)全长 29 891 bp，编码 9 860 个氨基酸，与2018年在中国东部舟山采集的源于蝙蝠的2种与SARS类似的冠状病毒bat-SL-CoV ZC45和bat-SL-CoV ZXC21同源性为88%，与SARS-CoV、MERS-CoV同源性分别为79%、50%[4]。

冠状病毒表面的刺突(spike, S)蛋白有重要的生物学功能，参与受体结合和介导病毒与宿主胞膜融合，是诱导中和抗体的主要抗原。SARS-CoV S蛋白中的受体结合域与宿主的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)结合，进而介导病毒进入宿主细胞。SARS-CoV的S1结构域(318-510AA)中的193个氨基酸片段已被确定为最小受体结合结构域(receptor binding domain, RBD)，足以与ACE2结合[5]。MERS-CoV与SARS-CoV的受体不同，其在人类细胞上的受体是二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP4)，也称为CD26。MERS-CoV通过表面S蛋白与DPP4结合，进而攻击人体细胞[6]。SARS-CoV-2受体结合域与SARS-CoV受体结合域非常相似。Wrapp等[7]确定了预融合构象中SARS-CoV-2的S蛋白三聚体冷冻电镜结构。研究发现，SARS-CoV-2利用高度糖基化的同源三聚体S蛋白进入宿主细胞，SARS-CoV-2与ACE2的亲和力为SARS-CoV的10～20倍。

2 冠状病毒疫苗的类型

接种疫苗是控制和预防传染病最经济、最有效的手段，但迄今为止还没有针对冠状病毒的商品化疫苗。目前针对SARS-CoV与MERS-CoV的疫苗研发主要包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗和核酸疫苗等种类。

2.1 灭活疫苗

将冠状病毒用物理或化学方法灭活，使其丧失毒力，但仍保留免疫原性。这样制成的疫苗具有许多优势，包括相对较低的生产成本和良好的安全性。用甲醛、紫外线或丙内酯灭活的SARS-CoV可在动物模型中诱导SARS中和抗体的产生[8]。中国已开发以灭活SARS-CoV为主的SARS候选疫苗，这是全球第一个进入临床试验的SARS 疫苗[9]。受试者一共接受了2剂SARS-CoV灭活疫苗。第1次接种42 d后，疫苗组的血清转化率达到100%。第2次疫苗接种后2周，中和抗体效价达到峰值，但4周后效价开始下降。该SARS-CoV灭活疫苗安全性良好，可诱导SARS-CoV特异性中和抗体的产生[10]。Tan等[11]用灭活的MERS-CoV与佐剂(铝和CpG寡脱氧核苷酸)配伍，在人DPP4转基因小鼠模型中可有效诱导产生针对MERS-CoV的保护性免疫应答。尽管灭活疫苗具有一定的保护作用，但需要注意的是，研究人员发现接种MERS-CoV灭活疫苗能诱导出中和抗体并降低人DPP4转基因小鼠的病毒载量，但再经MERS-CoV攻击时，可能引起机体的超敏反应型肺免疫病理反应[12]。此外，在制备SARS灭活疫苗时，处理高浓度的活病毒可能会对生产工人构成风险，且病毒的不完全灭活可能会在接种人群中引发SARS[13]。

2.2 重组亚单位疫苗

亚单位疫苗尽管免疫原性低，但相对其他疫苗而言具有较高的安全性。 S蛋白是冠状病毒与宿主细胞表面受体结合，进而介导病毒感染宿主细胞的关键蛋白。因此，大多数候选疫苗基于全长或部分截短的S蛋白进行重组构建，由S蛋白诱导的中和抗体在机体对抗致命冠状病毒时提供保护作用[14]。天然S蛋白以三聚体的形式存在，研究人员将MERS-CoV S蛋白与foldon结构域融合表达，使其自发形成三聚体结构，该蛋白在BALB/c小鼠中诱导出高效价中和抗体[15]。Zhou等[16]基于foldon结构域融合表达了RBD三聚体，并证明该疫苗对表达人DPP4转基因小鼠在受MERS-CoV攻击时有保护作用(存活率为83%)。RBD与人IgG Fc片段融合表达(RBD-Fc)的疫苗，可诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。Hotez等[17]应用中国仓鼠卵巢细胞稳定表达RBD蛋白，RBD蛋白经纯化后与MF59佐剂配伍，肌内注射到表达人DPP4的转基因小鼠后可在MERS-CoV攻击时产生保护作用，且没有免疫毒性或嗜酸性粒细胞免疫增强的证据。在恒河猴模型中，RBD(S367-606)与氢氧化铝佐剂配伍，与低剂量组相比，用高剂量组免疫的动物在受到MERS-CoV攻击后,肺炎严重程度减轻，同时病毒载量减少[18]。

除了将全长S蛋白和RBD作为亚单位疫苗的研究靶点外，也有研究者将S1蛋白N端结构域(N-terminal domain, NTD)作为疫苗新的靶点。S1的NTD不包含RBD，NTD可与细胞表面的病毒受体唾液酸结合，因此NTD是病毒感染宿主细胞的关键。Tan等[19]应用S蛋白的NTD作为另一种亚单位疫苗，免疫BALB/c小鼠后，在MERS-CoV攻击时可诱导中和抗体产生并减少小鼠的呼吸道病理反应。Hu等[20]基于免疫表位设计疫苗，发现高度保守的区域可以诱导产生中和抗体和针对MERS-CoV的细胞免疫。根据计算机对病毒蛋白抗原表位和结构的预测和分析，MERS-CoV的核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白可能是一种更好的保护性免疫原，具有较高的保守性并可诱导中和抗体的产生和细胞免疫应答。

病毒样颗粒(virus like particle ,VLP)是由病毒衣壳结构蛋白组成的、具有类似天然病毒颗粒空间结构的多聚体，同时不含有传染性遗传物质，即无复制性和感染性。VLP能展示病毒的不同表位，从而产生嵌合VLP(chimeric VLP，cVLP)。Xia等[21]构建的cVLP表面展示MERS-CoV受体结合域，可诱导产生RBD特异性中和抗体和细胞免疫应答。另外，冠状病毒中N蛋白和S蛋白的S2结构域相对保守，针对不同的冠状病毒有可能提供更广泛的保护[22]。

2.3 重组病毒载体疫苗

在减毒的病毒基因组中插入含有一种或多种外源保护性抗原基因获得的重组病毒，免疫机体后表达出相应的目的蛋白，从而诱导免疫应答，这类疫苗称为重组病毒载体疫苗。为了达到有效保护，冠状病毒疫苗不仅应引起体液应答，而且还应引起特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞应答。作为载体的痘病毒、腺病毒、麻疹病毒等已用于冠状病毒疫苗的开发。

2.3.1 痘病毒载体痘病毒具有基因组稳定性好、容量大、含多个非必需区基因、可被允许插入多个外源基因等优点。应用改良安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia Ankara virus, MVA)，表达不同长度的S蛋白片段(全长S、S1或RBD)，都诱导出了针对MERS-CoV的中和抗体和T细胞应答。Sutter等[23]应用修饰的MVA构建了针对MERS-CoV的病毒载体疫苗，其诱导的MERS-CoV特异性CD8+T细胞应答和中和抗体，能够保护表达人DPP4的小鼠免受MERS-CoV的攻击。

2.3.2 腺病毒载体腺病毒基因组大小适中，宿主范围广，对人致病性低，对于分裂和非分裂细胞均具有高转导效率。Tan等[24]应用2种重组腺病毒〔adenoviral type 5 (Ad5) 和type 41 (Ad41)〕编码MERS-CoV S蛋白，评估了单次肌内注射或灌胃给药腺病毒载体S蛋白(Ad-S)诱导的特异性免疫应答。灌胃给药Ad5-S或Ad41-S可诱导出特异性中和抗体；然而，未检测到特异性细胞免疫应答。单次肌内注射Ad5-S或Ad41-S，可诱导出中和抗体及细胞免疫反应。由于人群中普遍存在针对常见的人血清型腺病毒的中和抗体，影响了相应腺病毒载体在临床中的应用。采用黑猩猩型腺病毒(ChAdOx1)作为病毒载体，是基于ChAdOx1编码MERS-CoV S蛋白的疫苗可诱导出高水平中和抗体和特异性CD8+T细胞免疫应答[25]。ChAdOx1-S具有较高的免疫原性，单剂量鼻内或肌内注射表达人DPP4转基因小鼠，可抵御致命的MERS-CoV攻击[26]。

2.3.3 麻疹病毒载体在易感麻疹病毒(measles virus, MV)的小鼠中，表达全长S蛋白的重组MV诱导了高效价的中和抗体，使被免疫的动物免受鼻内感染SARS-CoV的攻击。与S蛋白(铝佐剂)免疫相比，重组的MV诱导了更强Th1细胞反应[27]。MVvac2-MERS-S(H)经紫外线灭活后免疫MV易感小鼠，未检测到MERS-CoV或MV的免疫应答，只有活的重组疫苗才能引发免疫反应。同时，编码MERS-CoV N蛋白的MV可诱导N特异性细胞免疫应答[28]。此外，新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)[29]和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)[30]作为病毒载体，均能诱导出中和抗体。

2.4 核酸疫苗

核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。核酸免疫是一个有吸引力的疫苗平台，可以快速开发疫苗，且具有较低的生产成本。但核酸疫苗存在病毒的遗传物质整合入宿主细胞染色体的潜在风险[31]。用编码SARS-CoV S蛋白的DNA候选疫苗免疫BALB/c小鼠，能诱导产生中和抗体、细胞免疫应答以及保护性免疫应答[32]。pVax1TM(GLS-5300)是首个进入临床试验的MERS-CoV DNA候选疫苗。该疫苗基于MERS-CoV保守的S蛋白，抗原经过密码子优化后以pGX9101为载体构建 DNA 疫苗，可在小鼠、猕猴和骆驼中诱导出有效的中和抗体和细胞免疫应答[33]。GLS-5300已完成了Ⅰ期临床试验[34]，受试者耐受性良好，无疫苗相关的严重不良反应。一剂次和两剂次免疫后受试者血清转化率分别为66%和86%，第60周时受试者血清转化率为79%。Graham等[35]改变疫苗接种方案，以肌内注射编码MERS-CoV S蛋白的全长DNA疫苗作为初次免疫，S1蛋白进行加强免疫，与仅接种S1蛋白相比，接受前一种免疫程序的恒河猴产生了更多的中和抗体，可降低严重的肺部病变。编码MERS-CoV S1基因的DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫应答，在没有佐剂的情况下产生高效价的中和抗体，接种疫苗后肺部细胞中的病毒载量显著降低[36]。

3 SARS-CoV-2疫苗的研究

根据SARS/MERS-CoV疫苗研发经验，开发SARS-CoV-2疫苗，以减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、核酸疫苗等多条研发技术路线同步开展，产生了多个平台的候选疫苗(表1)。在新技术与以往经验的双重助力下，疫苗的早期研发工作在研发人员获取病毒序列之后的2～3周内就已完成，并迅速进入动物实验阶段。目前在研疫苗共有14个，其中ChAdOx1 nCoV-19、INO-4800和SARS-CoV-2疫苗研究进度较快。

表1 SARS-CoV-2疫苗的在研情况*

4 结语

SARS-CoV-2疫苗的研发迫在眉睫，研发过程中应关注其安全性、免疫原性、免疫持久性等问题。冠状病毒感染存在抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement, ADE)作用，Altmeyer[37]等证明由SARS-CoV的全长S蛋白诱导的非中和抗体促进病毒通过FcγR依赖性途径进入宿主细胞，从而增强了病毒的感染性，这引发了人们对疫苗安全性的担忧。因此ADE是研制SARS-CoV-2疫苗中应关注的安全性的关键问题。

ACE2并非冠状病毒唯一受体，DC-SIGN和CD209L (L-SIGN)均可充当SARS-CoV的结合受体，促使病毒进入宿主细胞[38]，故而需对ACE2以外的受体加以关注。此外，有SARS-CoV疫苗研究表明，疫苗能够在幼鼠(6～8周龄)中诱导保护性免疫应答，但不能保护老年鼠(12～14月龄)[39]。因此需要针对疫苗在免疫功能低下和患有慢性疾病的人群及不同年龄群中的有效性进行研究。

对SARS治愈者进行长期随访发现，只有少数患者在发病6年后仍可检测到IgG抗体，存在中和抗体随时间推移逐渐减弱的现象。SARS-CoV感染后病毒特异性记忆CD8+T细胞持续存在长达6年，此时无法检测到记忆B细胞和病毒特异性抗体[40]。综上所述，有效的SARS-CoV-2疫苗应具有良好的安全性，有诱导体液免疫和细胞免疫应答的能力，同时具有较好的免疫持久性以提供长期的保护。

Lu等[41]对103株SARS-CoV-2全基因组进行了分子进化分析，发现病毒株已出现了149个突变点，而且多数是近期产生的。该研究揭示，SARS-CoV-2已经演化出L和S 2个亚型，其中101株属于这2个亚型。从占比上看，L亚型更为普遍，达到70%，S亚型占30%。作者认为L亚型和S亚型的传播能力、致病严重程度或许存在较大区别，L亚型可能更具侵略性，更易快速扩散。这种变异可能增加了SARS-CoV-2疫苗研制的困难。如果这些病毒亚型暴发流行，可能会给人们带来新一轮的挑战。

除此之外，关于冠状病毒疫苗的研发，还有以下几个问题需要投资者、研发人员及相关部门关注：①如果SARS-CoV-2像SARS-CoV一样，在疫情过后从人间消失或毒力减弱，成为普通冠状病毒，则将无须疫苗预防；②如果下一个类似的流行季再现，国家仍然采取一级响应，疫苗效力的评价则会面临挑战；③安慰剂对照试验是验证新药有效性的一个重要且难以替代的方法，但采用安慰剂对照试验可能会有道德风险。