中国黑龙江地区汉族人群FK506结合蛋白5基因多态性与精神分裂症的关联研究

王齐，冯磊光，叶向梅，王丹，宋志伟，蔡华枫，石国欣，计春辉，王丹凤

1 对象和方法

1.1 对象

患者组：为2017年6月至2018年6月本院精神科的住院患者。纳入标准:符合美国《精神障碍诊断与统计手册》第4版(DSM-Ⅳ) 精神分裂症诊断标准；生活在黑龙江地区,汉族；年龄20～60岁。排除标准:妊娠/哺乳期/绝经期女性患者、严重躯体疾病及酒精、烟草或其他精神活性物质滥用以及继发性精神障碍。共49例患者入组，男29例，女20例；平均年龄(41.2±9.4)岁。健康对照组：为2017年12月至2018年3月在本院体检中心性别、年龄与患者组相匹配的汉族健康体检者49名，均无精神病及精神病家族史；排除标准与患者组相同。其中男30名，女19名；平均年龄(41.47±11.23)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 FKBP5基因多态性检测方法 采集入组者空腹静脉血1.5 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，保存于-80 ℃冰箱中。基因组DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的全血基因组DNA提取试剂盒，严格按照说明书步骤操作，提取样本基因组DNA。基因扩增:引物由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成。FKBP5基因rs3800373、rs1360780、rs9296158、rs9470080位点引物序列见表1。PCR扩增体系：包括DNA模板系2 μl，dNTPs 2 μl，引物2 μl，2×PCR mix 7.5 μl，ddH2O 加至15 μl。PCR扩增体系试剂配好后加入到离心管中，混匀并放入PCR仪。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性3 min,94 ℃变性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃延伸3 min。PCR产物纯化：PCR产物用ExoI和FastAP纯化；ExoI作用是去除反应产物中的剩余引物，FastAP作用是去除反应中剩余的dNTP。反应总体系包括：3 μl PCR产物，0.2 μl ExoI，0.8 μl FastAP，0.7 μl ExoI buffer，2.3 μl H2O。反应条件：37 ℃15 min，80 ℃15 min；纯化后进行延伸反应。延伸反应：预先混合好延伸引物；反应总体系包括2 μl PCR产物，1 μl Snapshot Mix试剂，1 μl延伸引物，2 μl H2O；反应条件：96 ℃ 预变性1 min,96 ℃变性10 s,52 ℃退火5 s,60 ℃延伸30 s，30个循环。伸产物测序：取延伸产物1 μl加入10 μl上样Hidi，95 ℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪。

表1 引物序列

1.2.2 统计学方法 FKBP5基因各位点的基因型分布通过Hardy-Weinberg平衡来检测。采用SPSS 25.0统计软件，计量资料统计采用独立样本t检验，计数资料采用卡方检验；P<0.05有统计学意义。相关分析采用单因素Logistic逐步回归分析及多因素Logistic回归分析。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检测结果

两组FKBP5基因rs3800373、rs1360780、rs9296158和rs9470080位点实际基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 两组FKBP5基因各位点的基因型及等位基因频率比较

FKBP5基因rs1360780、rs9296158和rs9470080位点基因型及等位基因频率比较两组间差异无统计学意义；两组间 rs3800373基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，等位基因频率比较差异无统计学意义。见表2。

2.3 精神分裂症发病影响因素的Logistic回归分析

单因素Logistic回归分析显示，rs3800373位点以TT基因型为参照时， 精神分裂症发病风险GT是TT的0.298倍(95%CI：0.117～0.756，P=0.01)。rs3800373位点及性别、年龄与精神分裂症发病关系的多因素Logistic回归分析显示，以TT基因型为参照时，精神分裂症发病风险GT是TT的的0.289倍(95%CI： 0.108～0.723，P=0.01)；性别和年龄与发病风险的关系无统计学意义。见表3，见表4。

表2 两组FKBP5基因各位点的基因型及等位基因频率比较(例数，%)

表3 FKBP5基因多态性与精神分裂症发病的单因素Logistic回归分析

表4 精神分裂症发病的多因素Logistic回归分析

3 讨论

在精神疾病的研究中，调节应激反应的重要系统HPA轴被认为是许多精神疾病发病的共同通路。研究[1]表明，精神分裂症患者的HPA轴的活动水平增高、肾上腺皮质激素水平升高；抗精神病药对HPA轴的活动有影响[2]； 一些伴有糖皮质激素水平升高疾病患者通常有精神病性症状[3]；表明HPA轴的活动异常与精神疾病有关。

FKBP5基因编码FK506蛋白，该蛋白具有肽脯氨酰顺反异构酶活性和四肽重复蛋白结构域，可参与体内类固醇激素受体活化、免疫调节、蛋白质合成、折叠和转运等过程。其中，FKBP5可与热休克蛋白90及其伴侣蛋白结合并通过异构酶活性调节作用参与糖皮质激素受体复合物的形成和调控过程[4]，进而影响机体应激激素系统的功能，参与精神疾病的发生发展。糖皮质激素进入细胞质并与GR结合形成GR受体复合物再进入细胞核中发挥作用，该复合物一方面可以作为单体与其他转录因子相互作用，另一方面可以形成同源二聚体与糖皮质激素应答元件结合调控转录[5]，故其在应激激素系统中发挥重要作用。FKBP5与GR复合物的结合降低了糖皮质激素对GR亲和力，延缓GR向细胞核的转位[6]。所以FKBP5抑制GR活性导致HPA轴功能失调，进而影响精神分裂症的发生和发展。

本实验采用病例-对照研究方法，对49例精神分裂症患者和49名健康对照者FKBP5基因rs9296158、rs1360780、rs3800373、rs9470080位点的基因型和等位基因频率进行分析；结果仅见rs3800373位点基因型频率两组间差异有统计学意义(P=0.036)；其等位基因频率及其他3个位点基因型和等位基因频率两组间差异无统计学意义；Logistic回归分析显示，FKBP5基因rs3800373位点TT基因型的精神分裂症发病风险具有统计学意义(P=0.034)；性别和年龄对发病风险无统计学意义。

Mihaljevic等[7]研究发现，精神分裂症患者FKBP5基因rs3800373位点中G等位基因和rs9296158位点中A等位基因频率与正常对照组相比差异有统计学意义;而精神分裂症患者的健康兄弟姐妹与对照组间差异无统计学意义；证实了精神分裂症患者中FKBP5基因rs3800373位点的多态性改变是精神分裂症发病的危险因素。FKBP5基因rs3800373位点基因多态性改变可能通过增加FKBP5基因对GR的应答性使FKBP5与GR结合增多，抑制GR的作用，进而延缓糖皮质激素受体GR复合物进入细胞核，使其不能发挥对基因的转录调控作用，导致HPA轴功能失调，引发精神分裂症。Ajnakina等[8]对伦敦南部218名健康对照者和291例首发精神分裂症患者FKBP5基因rs1360780位点基因多态性研究发现，两组间该位点基因型和等位基因频率有明显差异；此与本研究的结果不同，原因可能与不同地域、民族及营养状况异质性有关；另外本研究样本量不大，可能对精神分裂症患者FKBP5基因的一些位点基因型分布的显现度不够。

还有研究[9-10]发现，FKBP5基因多态性与情绪处理、学习、记忆功能相关的大脑区域的功能和结构改变有关。Fani等[11]发现，因为海马功能过度激活，FKBP5基因风险等位基因携带者在应对环境带来的压力时表现得更为敏感。Holz等[12]认为，FKBP5风险等位基因携带者和儿童期遭受虐待者大脑杏仁核功能的激活程度增加。后扣带是一种与海马体相连的白质束，其促进了中枢和扣带皮质间的交流；后扣带结构连通性的差异可能取决于FKBP5基因rs1360780位点的等位基因状态[13]。海马体和杏仁核功能改变可导致意识和行为发生变化，因此FKBP5基因多态性在一定程度上影响着脑部功能。

本研究显示中国黑龙江地区汉族人群FKBP5基因rs3800373位点TT基因型携带者精神分裂症发病风险较高；目前国内没有相关报道。