酒制对瑞香狼毒抗肿瘤活性及毒性反应的影响

李红玲，宋美燕，马昊然，陆艺蓓，马晓莉，徐艳娇

(1. 河北大学 医学院，河北 保定 071000;2.河北大学 中医学院，河北 保定 071000)

瑞香狼毒(Stellerachamaejasme),又名红狼毒，藏药名称热甲巴，是瑞香科狼毒属植物，其干燥根可入药.中医圣典《本草纲目》、《名医别录》对狼毒的功效，均有记载：称其有“破积聚”、“除胁下积癖”[1]之功效，能“治痰饮癥瘕”[2].瑞香狼毒包含多种活性成分(萜类、香豆素、黄酮类化合物、木质素、多糖等)，药理作用包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调节免疫等[3-4].多项研究结果显示，瑞香狼毒对肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、肉瘤等多种肿瘤细胞均表现出显著的体内外抑制活性[5-8].

由于瑞香狼毒生品具有一定毒性，从而限制了其临床应用.将狼毒生品炮制(如醋制、奶制、酒制等)后，通过改变其化学成分的含量，能起到减轻药物毒副反应、增强药理功效的作用.其中，酒制可以增加瑞香狼毒的破痞功能[9-11].

本研究通过动物实验，比较了瑞香狼毒酒制品和生品对S180肿瘤细胞的体内抑制活性，并对其抗肿瘤作用机制进行了探讨，从而为瑞香狼毒的药物开发提供了实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

小鼠80只(4～6周)，昆明种，清洁级，雌雄各半，体质量(20±2)g，动物合格证编号：1811297，由河北医科大学动物学部繁育，饲养于河北大学医学部实验中心.S180肉瘤细胞，由中国医学科学院细胞资源中心提供.瑞香狼毒切片，马晓莉教授鉴定为正品，安国市昌达药材公司产品.

PBS磷酸盐缓冲液(粉剂)，抗原修复缓冲液(EDTA法)，过氧化物酶阻断液，封闭用山羊血清，Ki-67鼠抗人单克隆抗体(用PBS以体积比1∶100稀释备用)及生物素标记通用二抗，DAB显色试剂盒(20X)均为北京中杉金桥公司产品，Caspase-3兔抗人多克隆抗体(用PBS以体积比1∶100稀释备用)为武汉博士德公司产品.

1.2 实验仪器

倒置显微镜 (上海徕卡仪器有限公司)；电陶炉(上海元山电器工业有限公司)； 石蜡包埋机(上海徕卡)；捞片机(上海徕卡)；石蜡切片机(德国徕卡)；电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)；微波炉(广东格兰仕微波炉电器制造有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 瑞香狼毒的炮制及水煎液的制备

瑞香狼毒生药200 g，用1 000 mL的60度红星二锅头浸泡(时间不低于6 h)，再经文火加热、烤箱40 ℃烘干至白酒完全吸收(200 g瑞香狼毒生品炮制后，质量减至194 g).酒制及生品瑞香狼毒各取100 g，分别加水1 000 mL，浸泡0.5 h后大火煮沸，小火慢煎0.5 h后纱布过滤留取药汁.同法煎制第2次，将2煎药液合并，经大火煮沸浓缩、冷却离心去除药渣后，得250 mL澄明狼毒水煎液.部分原液用蒸馏水分别做2倍、4倍稀释，最后得药物质量浓度分别为0.4、0.2和0.1 g/mL的瑞香狼毒生品及酒制品水煎液各100 mL，于4 ℃冰箱内保存备用.

1.3.2 S180荷瘤鼠建模、随机分组、灌胃给药及观察指标

离心收集S180肉瘤细胞至1×107/mL，0.2 mL腹腔注射于4～6周昆明小鼠体内，建立S180腹水荷瘤小鼠模型.待接种7～9 d，小鼠腹水明显时，抽取小鼠腹水.0.2 mL腹腔注射于另1只4～6周的小鼠体内进行传代.取第3代腹水型荷瘤小鼠1只，于腹腔接种第9天抽取腹水，用无菌PBS进行稀释，将其调整至细胞浓度为1.5×107/mL的细胞悬液(活细胞数大于等于90%).以每只0.2 mL的剂量，皮下注射于小鼠左侧上肢腋下部位，干棉签按压片刻防止液体渗出.为保持瘤细胞活力，接种操作需在1 h之内完成.

昆明种小鼠80只，雌雄各半，体质量18～22 g.随机抽取10只作为空白对照组，剩余70只进行S180皮下荷瘤造模.于造模第2天，将荷瘤小鼠按体质量随机分成7个组：模型组、生药低中高剂量组(药物质量浓度分别为0.1、0.2、0.4 g/mL)、酒制低中高剂量组(药物质量浓度分别为0.1、0.2、0.4 g/mL)，每组10只，雌雄各半.

分组次日灌胃给药，每只小鼠每日1 mL，连续给药7 d.空白对照组、模型组给予生理盐水；瑞香狼毒用药组，分别给予低中高浓度的瑞香狼毒生药及酒制水煎剂.

于造模日开始，密切观察各组小鼠的饮食、饮水等情况，隔日测量体质量1次.造模第2日起，荷瘤鼠进行造模处超声检查，隔日1次.

1.3.3 指标测量

末次给药24 h后，将各组小鼠称质量后脱颈处死解剖，将瘤体、脾脏及胸腺取材并称质量，按下列公式计算各组小鼠的抑瘤率、脾指数、胸腺指数.

抑瘤率=(模型组瘤质量-用药组瘤质量)/模型组瘤质量×100%，

脾指数=脾质量(mg)/体质量(g)×10，

胸腺指数 =胸腺质量(mg)/体质量(g)×10[10].

多聚甲醛水(质量比4∶100)溶液固定肿瘤组织48 h后，依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋后制成石蜡切片.切片机切成4 μm薄片，于60 ℃烤箱内2 h烘干，进行HE染色并按试剂盒操作流程进行Ki-67、Caspase-3免疫组化(SP法)检测[12].显微镜下观察肿瘤组织HE及免疫组化染色结果.免疫组化结果鉴定标准为Ki-67阳性呈棕黄色，表达于肿瘤细胞的细胞核；Caspase-3阳性为黄褐色，表达于肿瘤细胞的胞膜或胞浆中.每组10只小鼠，每只小鼠取1张切片，每张切片取5个高倍视野(视野需完整且不重叠)计算得出每张切片的阳性反应率，公式为阳性率=阳性细胞数或阳性反应面积/肿瘤细胞总数或细胞总面积×100%.最后累计得出平均值.

1.4 统计学方法

实验数据用SPSS19.0软件进行分析处理，以均数±标准差表示，单因素、多因素及重复测量资料方差分析比较组内、组间差异，具有统计学意义的判定标准为P<0.05.

2 结果与分析

2.1 各组小鼠的抑瘤率、肿瘤体积、体质量、脾指数、胸腺指数比较

实验结果显示，瑞香狼毒生药及酒制组小鼠的瘤质量均小于模型组，F=7.616(P<0.01)；生药低中高剂量组小鼠的抑瘤率分别为34.80%、44.00%、33.18%，中剂量组最高(P<0.05)；酒制低中高剂量组小鼠的抑瘤率分别为46.80%、57.97%、54.95%，中剂量组最高(P<0.05).酒制瑞香狼毒组抑瘤率与同剂量的生药组相比，结果具有统计学差异(P<0.05)，结果见表1.

小动物超声检查结果显示：利用V=ab2公式计算各组荷瘤小鼠的肿瘤体积(a指肿瘤组织长度，b指肿瘤组织宽度).各组数据进行组内、组间对比分析，组内对比F=333.393，P≤0.001；组间对比F=2.687，P≤0.001，结果见表2.造模第8天，小动物超声检查可见小鼠造模区皮下有实质性的不规则低回声区，其边界欠清晰，回声区内可见点、片状的散在高回声钙化区，偶有液性暗区，结果见图1.

小鼠的体质量增长曲线结果发现：自造模第7天起，各组小鼠的体质量组间差异明显(P<0.05).与空白对照组相比，模型组及生药低、中剂量组小鼠的体质量增长缓慢(P<0.05)；酒制各剂量组小鼠体质量略高于生药组，但组间差异P>0.05，不具有统计学意义，结果见图2.

模型组、生药各剂量组小鼠的脾指数低于空白对照组，生药高剂量组小鼠脾指数最低(P<0.05)；与空白对照组相比，酒制各剂量组小鼠的脾指数略高，但组间差异P>0.05，没有统计学意义；酒制各剂量组小鼠的脾指数高于生药组(P<0.05).各组小鼠的胸腺指数结果显示，组间差异P>0.05，不具有统计学意义，结果见表1.

肿瘤组织的HE染色形态学观察发现：模型组肿瘤细胞形状不规则、大小不等，数量较多并且排列紧密；高倍镜下可见多个增殖细胞，胞核较大且呈分裂状、深染.瑞香狼毒各用药组的肿瘤细胞较模型组相比，排列稀疏，数量较少，高倍视野下可见大小不规则的坏死区，区内呈浅粉色，正常细胞结构消失，无胞膜，胞核消失或可见散在的碎裂胞核，坏死区周围有散在的、不同程度的白细胞浸润(图3).

图1 各组荷瘤小鼠造模第8天肿瘤超声影像Fig.1 Ultrasound image of tumor tissue of tumor-bearing mice in each group on the 8th day of modeling

图2 各组小鼠体质量增长曲线Fig.2 Mass growth curve of mice in each group

图3 各组荷瘤小鼠肿瘤组织形态学观察 HE染色(×400)Fig.3 Morphological observation of tumor tissue of tumor-bearing mice in each group HE staining(×400)

2.2 各组荷瘤小鼠Ki-67、Caspase-3免疫组化结果比较

免疫组化结果显示，生药及酒制瑞香狼毒各剂量组小鼠的Ki-67增殖指数明显低于模型组(P<0.05，P<0.01).生药低中高剂量组的Ki-67增殖指数分别为40.00%、29.23%、30.78%，中剂量组最低(P<0.05)；酒制低中高剂量组的Ki-67增殖指数分别为27.37%、26.50%、26.28%，高剂量组最低(P<0.05).酒制瑞香狼毒组Ki-67增殖指数与同剂量生药组相比，具有统计学差异(P<0.05).

瑞香狼毒各用药组小鼠的Caspase-3阳性表达率高于模型组，其中以酒制中高剂量组50.75%、40.40%的Caspase-3阳性表达率最高(P<0.01)，但生药各剂量组、酒制低剂量组的Caspase-3阳性表达率与模型组相比，组间差异P>0.05；与生药组相比，酒制各剂量组Caspase-3阳性表达率增高(P<0.05)，结果见表3.

免疫组化形态学观察发现：DAB常规染色后，镜下可见Ki-67阳性细胞呈现胞核棕黄色染色，模型组小鼠的Ki-67阳性细胞数量最多，生药及酒制瑞香狼毒各剂量组数量相对较少，结果见图4.Caspase-3阳性细胞的胞膜及胞浆呈现黄色或黄褐色，瑞香狼毒各用药组的黄色颗粒数量明显多于模型组，结果见图5.

图4 各组荷瘤小鼠肿瘤组织Ki-67免疫组化结果(DAB×400)Fig.4 Immunohistochemical results of Ki-67 in tumor tissue of tumor-bearing mice in each group(DAB×400)

图5 各组荷瘤小鼠肿瘤组织Caspase-3免疫组化结果(DAB×400)Fig.5 Immunohistochemical results of Caspase-3 in tumor tissue of tumor-bearing mice in each group(DAB×400)

3 结论

中药炮制是在辨证论治中医药理论体系下所形成的一种中国特有的制药技术.中医理论认为：通过炮制，可改变药材的四气五味、升降浮沉、归经等特性，从而导致其功效、用途发生相应变化，以达到辩证论治的用药目的.中医认为：酒，性味甘、辛，大热，具有活血通络、祛风散寒、引药上行、缓和药性、减毒等功效.多项研究结果显示：酒精是一种良好的溶剂，能溶解多种物质，如糖类、生物碱、挥发油、甙类、鞣质、有机酸等.经酒精浸润溶解后，能增强药物有效成分的置换和扩散，从而达到提高药物生物利用度的效果.本次实验结果证实：酒制后的瑞香狼毒对S180肿瘤细胞的抑制作用优于生品，提示酒制能提高瑞香狼毒的破痞功能，起到抗肿瘤增效的作用.

与空白对照组相比，酒制瑞香狼毒组小鼠体质量组间差异P>0.05，而生药组小鼠体质量增长减缓，可能与酒制能降低瑞香狼毒生药的毒性反应相关.同时，酒制组小鼠的脾指数高于生药组，提示酒制后的瑞香狼毒能提高小鼠的脾指数.该实验剂量的瑞香狼毒对胸腺的影响不大(胸腺指数组间差异P>0.05)，结果不具统计学意义.

抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡是公认的中药抗肿瘤的2种主要作用机制.采用免疫组化法，笔者对S180肿瘤细胞的增殖相关蛋白Ki-67、凋亡相关酶Caspase-3进行了定性和半定量分析[12].

肿瘤细胞的增殖，较正常细胞相比，具有不受控性.作为一个细胞增殖相关蛋白，Ki-67指数的高低，能体现细胞的增殖活性.其阳性率达到10%以上，则提示患有恶性肿瘤的可能性较高[13].研究显示，Ki-67的阳性率与多种肿瘤的分化程度、浸润、转移及预后息息相关[14].实验结果证实：与肿瘤对照组49.25%的阳性率相比，瑞香狼毒生药组及酒制组的Ki-67增值指数明显降低(P<0.05,P<0.01).酒制瑞香狼毒组Ki-67增殖指数与同剂量生药组相比，具有统计学差异(P<0.05).实验数据显示，酒制瑞香狼毒通过抑制Ki-67在S180细胞中的表达，减缓肿瘤细胞分裂增殖.

细胞凋亡是一种真核细胞特有的细胞消亡现象，具有主动有序、多基因调控的特点[15].研究发现，多种酶蛋白、基因对凋亡的启动调控具有调节作用.Caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)家族，在细胞凋亡执行过程中具有不可替代的作用，是凋亡启动的介导者和执行者.Caspase的激活，是公认的最佳凋亡生化标志.Caspase-3是凋亡最重要的执行者，是种类庞大的Caspase家族中最重要的效应型蛋白酶，处于凋亡有序级联反应的下游[16].实验结果证实,酒制中高剂量组Caspase-3的阳性表达率显著性增高(P<0.01)，表明中高剂量的酒制瑞香狼毒能通过促进Caspase-3活化,诱导S180肿瘤细胞发生凋亡.