中国传统固态发酵食醋主要特征风味物质组成分析

郑 宇 程 程 刘 静 刘小菁 谢晓琳 徐 迎 宋 佳 王 敏

（食品营养与安全国家重点实验室 工业发酵微生物教育部重点实验室天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心 天津科技大学生物工程学院 天津300457）

中国传统食醋主要以高粱、 糯米等谷物为主要原料发酵生产，是深受人们喜爱的酸性调味品。根据发酵工艺， 我国传统食醋主要分为液态发酵食醋（如福建永春老醋、浙江玫瑰醋等）和固态发酵食醋，如山西老陈醋（Shanxi Extra Aged Vinegar，SEAV）、镇江香醋（Zhenjiang Aromatic Vinegar，ZAV）和四川保宁麸醋 （Sichuan Bran Vinegar，SBV）等[1]。其中，山西老陈醋、镇江香醋等传统食醋先后被评为国家地理标志性产品[2-3]。

食醋不仅是调味食品，还具有缓解疲劳、促进食欲、软化血管等保健功效[4]。 食醋的风味与营养价值与其丰富的有机酸、 氨基酸和糖类物质密切相关[5]，是衡量食醋品质的主要指标[2-3]。 有机酸是食醋酸味的主要来源， 大部分有机酸是在发酵过程中由微生物产生，也有一小部分来源于原料。食醋中的有机酸由挥发性和不挥发性有机酸组成，挥发性有机酸主要为乙酸， 不挥发性有机酸包括乳酸、苹果酸、柠檬酸和酒石酸等[6]。有机酸的组成与含量对食醋的酸味质量及产品特色有重大影响，乳酸、乙酸在酿造食醋和配制食醋中相对含量差异较大， 酿造食醋和配制食醋中乳酸和乙酸分别占到总有机酸含量的14.28%和84.11%， 以及4.31%和95.02%[7]。通过测定食醋有机酸中碳的稳定同位素比例，发现不同产地、不同酿造原料食醋中乳酸和苹果酸的δ13C 具有显著性差异[8]。有机酸对食醋的口感具有重要影响[9]，如琥珀酸可增强醋的鲜味，乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等可缓冲乙酸的刺激性，使醋液酸味柔和、醇厚[10]。 食醋中含有丰富的氨基酸，可产生鲜、甜、苦不同的风味，调和了食醋的刺激口感。 氨基酸主要来源于原料中蛋白的水解以及微生物代谢产生[11]。 不同种类酿造食醋中氨基酸的种类及含量均存在差异， 这可能与其酿造原料、发酵方式、菌种、陈酿时间等有关， 通过测定不同食醋的氨基酸含量并结合指纹图谱可对不同种类的食醋进行区分[12]。 食醋中的糖类物质为食醋带来甜味，使食醋酸味更加柔和。糖类物质主要来源于发酵原料， 不仅为发酵过程微生物的生长提供营养物质， 还是风味物质形成的前提。 同时， 由于醋醅中氨基酸和还原糖的存在，在食醋酿造过程中还会发生美拉德反应，其产物如类黑精、糠醛和吡嗪类化合物对食醋的风味、颜色和稠度等都起到很大作用[13]。

食醋的整体风味主要由气味和滋味， 即挥发性成分和不挥发性成分两部分组成。其中，不挥发性成分主要由有机酸、氨基酸和糖类物质组成。在食醋感官分析中，不同物质的感官阈值差异很大[14]，对食醋整体风味的贡献是由其在食醋风味体系中的浓度和感觉阈值共同决定的[15-16]。 滋味活度值（Taste activity value，TAV）被计算为食物基质中单个化合物的浓度与其相应的味觉阈值的比率。虽然滋味活度值法没有考虑食物基质中化合物之间掩蔽，增强或加合作用的影响，但是滋味活度值法仍可为评价特征风味活性化合物提供有效的参考[17]。 应用滋味活度值法评价食醋中的特征风味物质的优势在于可以将化学信息和感官描述信息有效地结合起来， 使得所筛选的食醋中特征风味物质更科学、客观。

我国传统固态食醋工艺独特， 营养与风味物质组成丰富， 目前对不同地区食醋的风味物质组成特征仍不清晰。本文主要对山西老陈醋、镇江香醋、 四川麸醋3 种著名固态食醋风味物质进行检测， 重点结合发酵原料及工艺对其风味物质组成特征进行分析， 利用滋味活度值法和因子分析方法确定主要的特征风味物质， 并建立区分不同地区食醋的聚类分析模型， 有利于进一步加深对我国传统食醋的认识。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器、设备

1.1.1 样品采集 共采购37 个用固态发酵技术生产的食醋样品，分别产自山西太原、山西晋中、江苏镇江和四川南充，共包括21 个山西老陈醋样品，12 个镇江香醋样品和4 个四川麸醋样品。 采购的山西老陈醋和镇江香醋产品分别符合GB/T 19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》和GB/T 18623-2011《地理标志产品镇江香醋》。 由于山西老陈醋生产企业较多，为体现代表性，选购的样品数量也较多，产品相关信息见表1。

1.1.2 仪器与设备 Agilent1200 高效液相色谱仪（紫外检测器）， 美国安捷伦仪器有限公司；Agilent1260 高效液相色谱仪（蒸发光检测器），美国安捷伦仪器有限公司；S-433 D 氨基酸自动分析仪，德国赛卡姆公司。

1.2 试验方法

1.2.1 固态发酵食醋主要风味物质组成分析 分析3 个地区37 种食醋样品的有机酸、氨基酸和糖类物质组成。 不同食醋样品之间的总酸含量存在差异，为在同一水平比较食醋的差异及共性，将食醋中有机酸、 氨基酸和糖类物质的含量换算为单位酸度下的浓度进行比较分析。 食醋样品的酸度为其滴定酸度（以乙酸计），每1 g/L 滴定酸度为1个酸度单位（Titer）。

1）有机酸和氨基酸风味分析 计算单位酸度下有机酸、氨基酸滋味强度值（TAV），即单位酸度下各呈味物质的含量与其阈值的比。 采用滋味活度值法分析固态发酵食醋中主要有机酸和氨基酸对食醋滋味的贡献度。

食醋中有机酸阈值见表2。 由于目前没有关于食醋中苹果酸的阈值描述， 所以本文选择8 名食品专业人员进行风味品评培训， 采用感官品评方法确定食醋中苹果酸的阈值。 食醋本身含有苹果酸，本试验测定阈值的类型为差别阈值。有机酸的差别阈值为添加到食醋中使食醋酸感增强的浓度。 根据表3，在测试食醋中加入不同浓度的苹果酸， 被测样品所添加苹果酸浓度按照固定常数（0.01 g/L）依次增加。 采用三点检验法，品评人员从3 个样品中确定其中唯一的差异样品。 对于每个品评员， 其个体阈值是最后一个判断不正确的浓度值和下一个判断正确的浓度值的几何平均数。 小组阈值是个体阈值的几何平均数。

食醋中氨基酸阈值见表4。

2）糖类物质风味分析 由于糖类物质滋味强度以相对甜度值来表述，主观性较强，因此评价食醋中特征糖类物质时， 采用因子分析方法对单位酸度下糖类物质的浓度进行综合打分。 因子分析将具有错综复杂关系的变量降维成少数几个因子以再现原始变量与因子之间的相互关系， 并给予不同变量相应得分。 根据本研究中对不同地区传统食醋样品风味物质的分析，综合得分的高、低排名， 解释为该化合物对食醋样品风味贡献率的排名。

1.2.2 固态发酵食醋风味物质特征分析

1）固态发酵食醋特征风味物质组成分析及样品聚类分析 由于不同食醋样品总酸浓度各不相同， 并且食醋中有机酸和氨基酸的含量和阈值有较大差异，因此分别选择单位酸度下TAV 较高的有机酸和氨基酸，以及综合得分≧50 的单糖化合物进行综合分析， 解析单位酸度下固态发酵食醋中贡献较大的风味物质组成。

表1 食醋样品信息Table 1 The information of vinegar samples

表2 有机酸风味描述及阈值Table 2 The flavor description and threshold of organic acid

表3 苹果酸阈值的测定Table 3 Determination of citric acid threshold in vinegar

表4 氨基酸风味描述及阈值Table 4 The flavor description and threshold of amino acid

对筛选出的主要风味物质进行分析、 组合，采用聚类分析方法比较不同组合下3 类样品类内相似性及类间相似性， 选择类内相似性值最高，同时类间相似值最小组合，认为是固态发酵食醋特征风味物质组成。 为得到更可靠和相对全面的分析结果，所选组合的指标个数不少于8。当类内相似性大于85%时，认为同种样品具有良好的相似性；当类间相似性小于75%时，认为可以区分不同地区的样品。

2）固态发酵食醋聚类分析方法的验证 重新购买不同地区的食醋样品（各2 个），分别测定其特征有机酸、氨基酸和单糖，进行聚类分析，验证特征风味物质的有效性以及聚类模型的可靠性。

1.3 分析方法

1.3.1 有机酸的测定

1）紫外-HPLC 检测条件 色谱柱：Aminex HPX-87H 离子排斥色谱柱（7.8 mm×300 mm）；柱温：30 ℃；流速：0.6 mL/min；紫外检测器波长：215 nm；流动相：5 mmol/mL 硫酸；运行时间：30 min。

2）食醋样品预处理方法 将食醋样品稀释10 倍，取2 mL 稀释液于2 mL EP 管内，以12 000 r/min 转速离心5 min，取上清液，滤液经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC 检测，每个样品重复测定3次。

3）定性、定量方法 以保留时间和样品加标定性， 将所测有机酸标准溶液在同样的色谱条件下进样，绘制标准曲线，采用外标法定量。

1.3.2 游离氨基酸的测定

1）氨基酸自动分析仪检测条件 检测柱：Na+型阳离子分离柱（LCA K06）；柱温：30～70 ℃；紫外检测器波长：570，440 nm；缓冲液：钠盐缓冲液，流速0.45 mL/min，梯度洗脱；衍生试剂：茚三酮溶液，流速0.25 mL/min；进样量：50 μL；分析时间：60 min；反应温度：130 ℃。

2）食醋样品预处理方法 将醋样稀释20倍，取200 μL 稀释样品，加入800 μL 2%水杨酸，静置30 min，13 000 r/min 离心15 min， 取离心后的上清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，待测。

3）定性定量方法 将SYKAM 公司原装H 型氨基酸标准溶液稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样确定保留时间，绘制标准曲线，采用外标法定量。

1.3.3 单糖的测定

1）蒸发光-HPLC 检测条件 色谱柱：ES 糖分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μ）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；蒸发温度：90 ℃；载气：空气；载气流速：2.2 L/min；流动相：乙腈-水（体积比75∶25）。

2）食醋样品预处理方法 将样品适当稀释，取2 mL 稀释液于2 mL EP 管内， 以12 000 r/min转速离心5 min，取上清液，滤液经0.45 μm 滤膜过滤后进行HPLC 检测。 每个样品重复测定3 次。

3）定性定量方法 将各单糖标准品储存液稀释成一系列不同浓度的溶液， 分别进样确定保留时间， 并将不同的糖类物质标准品以一定比例混合后进样，得到糖类物质混合标准曲线，采用外标法定量。

1.3.4 数据处理与分析方法 采用OriginPro 9.1进行试验数据的统计处理， 食醋样品中糖类物质因子分析采用IBM SPSS Statistics 软件。 采用Minitab 16.0 软件进行聚类分析。

2 结果与讨论

2.1 固态发酵食醋中有机酸、氨基酸和单糖组成分析

2.1.1 有机酸组成分析 食醋是世界上使用最广泛的酸性调味品，不同食醋的酸味各具特色，主要与其酿造原料、工艺和气候相关[19]。 为了比较不同固态发酵食醋中有机酸组成的差异， 对来自不同地区的典型固态发酵食醋样品中的有机酸进行测定。为便于分析比较，以单位酸度下有机酸浓度表示，如图1 所示。从山西老陈醋和镇江香醋中均检测到8 种有机酸， 含量较高的有机酸依次为乙酸（0.89～0.91 g/L/Titer ）、乳酸（0.47～0.56 g/L/Titer）和柠檬酸（0.037～0.046 g/L/Titer）。 从四川麸醋中共检测到6 种有机酸， 其中乙酸占总有机酸的比例低于其它样品，乳酸所占比例则高于其它样品。食醋中的大部分有机酸是在制曲和发酵过程中由醋酸菌、乳酸菌、酵母菌等微生物产生的。另外，还有部分有机酸来源于原料。 大米中有机酸至少有15 种， 大曲中有机酸含量约为大米中的2 倍多[20-22]。山西老陈醋的酿造原料以高粱为主，属于C3 植物；而镇江香醋大多为糯米、大米等，属于C4 植物[8-23]。 不同的酿造原料中含有的有机酸不同， 更为重要的是酿造工艺对微生物的组成及演替有重要影响， 从而导致不同地区固态食醋中有机酸组成的差异。 有研究发现四川麸醋的生产工艺更有利于乳酸菌的生长， 从而积累了大量的乳酸[24]。

固态发酵食醋中乙酸和乳酸占总有机酸含量的80%以上，是食醋中浓度最高的有机酸，且分别属于挥发性和不挥发性有机酸，说明乙酸/乳酸值对食醋的风味有重要影响。由图1 可知，在3 个地区的食醋样品中，四川麸醋乙酸/乳酸值最小（1.19± 0.15），山西老陈醋的最高（1.88±0.06），镇江香醋的次之（1.62±0.07）。 气候差异、酿造原料和酿造工艺的不同使得不同品牌食醋的乙酸/乳酸值产生差异， 形成各具特色的食醋风味及口感。 乙酸/乳酸值可作为潜在的特征指标用于评价不同地区食醋之间的差异。

图1 食醋样品单位酸度下有机酸含量Fig.1 The organic acid content per titer of vinegar samples

有机酸组成及含量是导致食醋各具特色的重要原因。 根据单位酸度下每种有机酸含量及对应的味觉阈值， 来评价每种有机酸对食醋的整体酸味贡献情况，比单独用有机酸绝对浓度更有意义。因缺少苹果酸在食醋中的阈值， 故本文首先分析了食醋中苹果酸的阈值，结果见表4。 食醋样品单位酸度下有机酸的TAV 如表5 所示，乙酸和乳酸的味觉强度分别占总酸味强度的52.35%～63.35%和31.90%～41.53%，柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、草酸和苹果酸的味觉强度分别占总酸味强度的1.10%～2.07%，0.32%～0.52%，0.68%～1.35%，0.24%～0.25%和0.38%～2.22%。 在3 类食醋样品中，乙酸和乳酸仍是呈味的主体有机酸， 其它有机酸辅助协同形成各具特色的酸味口感。 综上，乙酸、乳酸以及乙酸/乳酸值可作为潜在的特征指标来分析不同地区食醋之间的差异。

2.1.2 氨基酸组成分析 氨基酸能增强食醋的缓冲能力，缓和食醋的刺激酸味。 同时，氨基酸参与的美拉德反应会产生更多的香气物质， 对食醋的风味有重要影响。共检测食醋样品中的16 种游离氨基酸，单位酸度下这些氨基酸的浓度见表6。

镇江香醋和四川麸醋中含量较高的3 种氨基酸分别为丙氨酸（0.034～0.064 g/L/Titer）、亮氨酸（0.026～0.036 g/L/Titer）和胱氨酸（0.023～0.034 g/L/Titer）， 而山西老陈醋中胱氨酸浓度则较低（0.0019±0.0003 g/L/Titer），3 个地区食醋样品中含量最高的氨基酸均为丙氨酸。 高粱中胱氨酸含量为0.03 g/100 g，麸皮中胱氨酸含量为0.19 g/100 g，大米中胱氨酸含量为0.55 g/100 g[25-26]，说明麸皮、大米中的胱氨酸含量要高于高粱中的含量。山西老陈醋的酿造原料主要是高粱，其次是麸皮，还有由大麦和豌豆制得的大曲； 镇江香醋的酿造原料主要是大米和大曲； 四川麸醋主要以麸皮为酿造原料。 酿造原料的差异可能是不同固态发酵食醋中氨基酸组成差异的主要原因。此外，四川麸醋中的总氨基酸含量最高（0.34±0.038）g/L，使四川麸醋具有酸而不涩，香而微甜的独特口感，这一方面是因其原料麸皮中各氨基酸含量较高； 另一方面与四川麸醋采用药曲作为发酵剂有关[27]。

表5 食醋样品单位酸度下有机酸滋味活度值Table 5 TAV of the organic acids per titer of vinegar samples

表6 食醋样品单位酸度下氨基酸含量Table 6 The amino acid content per titer of vinegar samples

根据游离氨基酸的风味强度， 将对风味有贡献的氨基酸分为鲜味氨基酸、 甜味氨基酸和苦味氨基酸[28]。 计算各氨基酸在单位酸度下的TAV，结果见表7。 3 个地区食醋样品中谷氨酸（0.035～0.078）、丙氨酸（0.044～0.110）和组氨酸（0.039～0.110）的TAV 均最高，说明这3 种氨基酸对食醋滋味的贡献较大。食醋中甜味和鲜味明显，苦味不明显，其原因可能是苦味被甜味掩盖[29]。 综上所述，选择谷氨酸、丙氨酸、组氨酸和胱氨酸作为特征氨基酸用于后续食醋的聚类分析。

表7 食醋样品单位酸度下氨基酸滋味活度值Table 7 The TAV of amino acids per titer of vinegar samples

2.1.3 单糖分析 糖类物质是食醋甜味的主要来源。 酿醋原料要先糖化， 之后酒精发酵和醋酸发酵。发酵过程中会有一部分糖残留下来，进入成品醋中。由于个别产品出厂前用蔗糖调整甜度，所以本文检测食醋样品中有5 种主要的单糖。 单位酸度下糖类物质浓度如图2 所示，3 个地区食醋样品中含量较高的单糖分别为葡萄糖（0.15～0.65 g/L/Titer）、果糖（0.067 ～0.27 g/L/Titer）和甘露糖（0.089～0.38 g/L/Titer）。 其中，四川保宁麸醋中的单糖浓度较高，山西老陈醋的最低。发酵制品中糖类物质的种类及含量是反映原材料、 微生物环境与产品质量的重要指标，其来源比较复杂，葡萄糖在食醋发酵过程中被微生物生长代谢并利用，部分醋酸菌还可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸[6]。甘露糖广泛存在于植物以及微生物体内， 存在的形式有游离状态、化合状态。部分学者认为甘露糖是在微生物发酵的过程中形成的， 也有学者提出甘露糖是果糖经多元醇氧化还原酶转化而成的[5]。 肌醇、甘露糖均属于六元醇， 主要来源于原料与微生物代谢[19]。 虽然这些糖类的甜度和含量各不相同，但是它们共同构成了食醋的甜味， 对食醋风味有着重要的影响。

食醋的甜味不仅取决于糖的种类和含量，还受酸影响， 二者的适宜比例对于食醋的风味品质极为关键。 因子分析重点解释了各变量之间的协方差， 可在复杂的原始数据中得到少数几个因子去描述众多指标之间的联系， 即以较少因子反映原始数据的大部分信息。 单位酸度下5 种单糖的因子分析综合打分结果见表8。 葡萄糖和甘露糖的得分大于0， 说明它们的贡献率大于平均水平且对不同食醋样品风味影响较大。 甘露糖和葡萄糖二者具有较高的甜度，是食醋甜味的主要来源，易于吸收，并直接参与机体新陈代谢过程。选择葡萄糖和甘露糖作为潜在的特征风味物质组成用于后续聚类分析。

2.2 固态发酵食醋有机酸、氨基酸、糖类组成特征分析结果

2.2.1 固态发酵食醋特征风味物质组成 我国传统固态食醋营养与风味物质组成丰富，然而，不同地区食醋的化合物组成特征仍不清晰。 聚类分析是将物理或抽象对象的集合分为由类似的对象组成的多个类别的分析过程， 其实质是按照距离的远近将数据分为若干个类别， 使得类别内数据的差异尽可能小，类别间差异尽可能大。通过对食醋样品中有机酸、氨基酸、糖类等主要风味物质的分析，发现单位酸度下乳酸、乙酸/乳酸、谷氨酸、丙氨酸、组氨酸、胱氨酸、葡萄糖和甘露糖共9 个指标对食醋风味品质影响最大。 本文选择这9 个关键指标进行聚类分析， 希望找出同地区食醋的共同特点，以及不同地区食醋之间的差异，解析我国固态发酵食醋的潜在特征风味物质组成。 对筛选出的9 种潜在指标进行组合， 比较不同组合下样品类内相似性数值与类间相似性数值， 得到最优的组合，即类内相似性值最高、同时类间相似值最小组合。 为得到全面、准确的分析结果，所选组合的指标个数不少于8，共试验10 种组合方法。 首先对数据进行标准化处理，消除不同指标、不同纲量带来的影响，而后进行聚类分析，结果见表9。

比较不同组合的类间相似性和类内相似性，结果第2 号组合得到最优的聚类分析结果， 即乳酸、乙酸/乳酸、谷氨酸、丙氨酸、组氨酸、胱氨酸、葡萄糖和甘露糖作为特征性指标时能够有效区分不同地区的食醋，3 种固态发酵食醋的类内相似性高于90%，类间相似性小于70%，聚类分析结果见图3。

图2 食醋样品单位酸度下糖类物质含量Fig.2 The carbohydrate content per titer of vinegar samples

表8 食醋样品单位酸度下糖类物质主成分综合得分Table 8 Comprehensive scores of carbohydrate per titer of vinegar samples

2.2.2 固态发酵食醋样品聚类分析结果的验证

验证这8 个指标区分固态发酵食醋的有效性，重新购买来自3 个地区的6 种样品，对其中的有机酸、氨基酸和糖类等指标进行检测，采用所建立的方法进行聚类分析，结果如图4 所示。

由图4 可知，用于验证的6 个食醋样品中，1，2 为山西老陈醋样品；3，4 为镇江香醋样品；5，6为四川麸醋样品。 聚类分析结果显示3 个地区的食醋样品被分为3 类， 验证了该方法用于我国固态发酵食醋区分的准确性与重复性。 乙酸、乳酸、乙酸/乳酸、谷氨酸、丙氨酸、组氨酸、胱氨酸和甘露糖8 个指标可作为主要的特征风味指标， 用于区分我国固态发酵食醋。

表9 不同风味物质组合聚类分析结果Table 9 Results of cluster analysis of different combinations

图3 食醋样品主要特征风味物质的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of vinegar samples based on main flavor substance

3 结论

图4 固态发酵食醋样品聚类分析方法验证Fig.4 Verify of the cluster analysis of solid-state fermented vinegars

总酸、 氨基态氮和还原糖是衡量我国食醋品质的主要指标，酿造原料、工艺等对我国固态发酵食醋中有机酸、 氨基酸和单糖等主要营养与风味物质组成有较大影响。 不同食醋产品的酸度值各不相同， 常规的化合物浓度分析难以真实反映不同食醋的风味特征。 本文通过分析比较单位酸度下有机酸、 氨基酸以及糖类化合物的滋味活度值（TAV），筛选获得乙酸、乳酸、乙酸/乳酸、谷氨酸、丙氨酸、组氨酸、胱氨酸和甘露糖等8 种特征性风味指标，对这些指标进行聚类分析，其最优聚类模型能够有效区分山西老陈醋、 镇江香醋和四川麸醋3 种固态发酵食醋。