化脓隐秘杆菌HJ-1 型生长曲线与感染小鼠半数致死量的测定

赵明迪，范春玲，周玉龙，孙斌，郭东华，原冬伟，吴海燕，崔超伟，燕传利

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.黑龙江省青龙山农场；3.山东省广饶县畜牧局）

化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes），于1893年首次发现，原称化脓棒状杆菌（Corynebacterium pyogenes），化脓放线菌（Actinomyces pyogenes），1997年pascual Ramos et.al 将该菌从放线菌属中重新分类为隐秘杆菌属[1-2]。2011 年对化脓隐秘杆菌基于16 SrrNA 的系统进化分析、磷脂组成和维生素K2 的存在与否等把A.pyogenes 被重新命名为Trueperella pyogenes（T.pyogenes），归属于Trueperella 属。

化脓隐秘杆菌在隐秘杆菌属中致病性最强，同时也是一种条件性致病菌，化脓隐秘杆菌不仅感染牛羊猪等经济类动物，同时也会感染猫，狗，兔，狐狸，猴，鹅，鸭等其他动物，王一涵等[3]从猪呼吸道分离鉴定出化脓隐秘杆菌。王丹[4]从奶牛乳房炎病例中分离出化脓隐秘杆菌。李章程等[5]在山羊皮下脓肿病料采集中分离出化脓隐秘杆菌。杨乐等[6]从病牛病料中分离出化脓隐秘杆菌。王居海等[7]从犊牛化脓性肺炎中分离出化脓隐秘杆菌。赵克雷等[8]在林麝脓灶中分离出化脓隐秘杆菌。化脓隐秘杆菌不仅能感染各类动物，随着近年来化脓隐秘杆菌的报道，也出现人类感染化脓隐秘杆菌的病例，Gomez-Mateos J，et al[9]在心内膜炎病例中分离出化脓隐秘杆菌，并确定化脓隐秘杆菌为主要病原菌。魏绪廷等[10]从糖尿病患者背痛引流中分流出化脓隐秘杆菌。也有人感染化脓隐秘杆菌的病例，是一种重要的人兽共患病。近年来，虽然对化脓隐秘杆菌有一定的研究，但化脓隐秘杆菌的致病机理尚不明确并缺乏有效的治疗手段与预防机制，长期以来对我国的养殖业造成巨大的经济损失并威胁人类的健康与安全。

化脓隐秘杆菌为革兰氏阳性菌种，且不易染色，具有多形性，多呈逗号状、弧形或者短杆状，无荚膜和芽孢，菌体着色不均，常散在，也有呈丛或2～4 个并列排列[3]。化脓隐秘杆菌的生长温度为20～40 ℃，其中最适宜生长温度为37 ℃。好氧或兼性好氧，在5%～10% CO2环境条件下或添加血液、血清可促进其生长。化脓隐秘杆菌在血琼脂培养基上培养24～48 h后可形成针尖状、表面光滑的、灰白色、直径1 mm 的菌落，并且在菌落周围形成β-溶血环。

化脓隐秘杆菌能引起化脓隐秘杆菌病，自化脓隐秘杆菌于1983 年首次发现以来，世界各地相机发现此病菌，近年来发病率呈上升趋势，化脓隐秘杆菌常引起牛化脓隐秘杆菌肺炎，临床症状常以咳嗽、流脓性鼻汁、化脓性肺炎，以及关节炎为主。其他动物感染化脓隐秘杆菌常引起心内膜炎、肝脏脓肿、乳腺炎、子宫内膜炎、骨髓炎、流产、子宫感染而导致的不育与精囊炎等症状。给养殖业带来了一定的经济损失，目前化脓隐秘杆菌的致病机理尚不明确，所以给治疗与防控化脓隐秘杆菌造成了一定的困难。为了研究化脓隐秘杆菌的致病性，与免疫性，生长曲线与毒力测定是重要的实验数据，实验采用BHI 液体培养基对化脓隐秘杆菌HJ-1 进行培养，通过测定生长曲线对化脓隐秘杆菌HJ-1 的生长规律进行了解，同时测定化脓隐秘杆菌HJ-1 菌株对小鼠的半数致死量，为后续化脓隐秘杆菌的疫苗研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与实验动物

化脓隐秘杆菌HJ-1 型由黑龙江八一农垦大学周玉龙老师惠赠。黑龙江八一农垦大学兽医预防实验室保存。6 周龄SPF 级昆明小鼠，雌性，体重18～22 g，购自辽宁省长生生物技术股份有限公司。

1.1.2 主要试剂

革兰氏染色液试剂盒购。脑心浸液（BHI）液体培养基、营养琼脂、优质胎牛血清、血液营养琼脂培养基、普通营养琼脂、普通肉汤、血液营养琼脂平板。

1.1.3 主要仪器

ZHJH-1112 超净工作台，BXP-280S 微生物培养箱，MLS-3750 高压灭菌器，MoticBS 光学显微镜及成像系统，UV-2600 分光光度计，TG16 离心机，HZ80恒温摇床。

1.2 方法

1.2.1 化脓隐秘杆菌HJ-1 型的纯化培养

将实验室保存的化脓隐秘杆菌HJ-1 型株使用无菌接菌环，三线法接种到血液营养琼脂培养基上，放置于37 ℃恒温培养箱培养48 h，当血液营养培养基上出现β-溶血环和透明针尖样菌落，挑取单菌落接种于5%血清的BHI 液体培养基中，置于37 ℃恒温摇床，培养30～48 h，观察BHI 液体培养基浑浊度。

1.2.2 化脓隐秘杆菌HJ-1 型生化鉴定

取BHI 液体培养基培养的菌液1 mL，12 000 rpm离心3 min，弃去上清液，用无菌接菌环勾取沉淀物进行涂片并进行革兰氏染色。准备干净载玻片，并用95%酒精擦净，纱布擦干，取生理盐水滴与载玻片上，用无菌接菌环将菌落沉淀均匀涂匀，使其成为均匀的薄层。将载玻片涂面向上，背面在酒精灯的火焰上反复通过几次进行固定。初染：滴加草酸铵结晶紫，以刚好将涂菌区覆盖为好，染色2 min，水洗。媒染：用碘液冲去残留的水，并用碘液覆盖2 min，水洗。脱色：弃去载玻片上残留的水，用滴管滴加95%的乙醇充分覆盖，脱色30 s，迅速水洗。复染：弃去载玻片上残留的水，滴加复红染液，使其完全覆盖2 min，水洗，用滤纸吸干。使用显微镜油镜对细菌的形态与特征进行观察并取菌液进行细菌生化鉴定实验。

1.2.3 化脓隐秘杆菌HJ-1 型生长曲线的测定及细菌计数

将化脓隐秘杆菌HJ-1 型纯培养后，取37 ℃恒温摇床培养48 h 的化脓隐秘杆菌HJ-1 型菌液，按1%的比例接种到30 mL 5% BHI 液体培养基中，于37 ℃80 rpm 恒温培摇床中培养，分别在培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 各时间点取菌液1 mL，并以5%BHI 液体培养基为对照组测定其OD600值，每个时间点重复测定3 次，取其平均值。

取 培 养 至2、4 、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 时间点的化脓隐秘杆菌的菌液，做10 倍比稀释，即取100 μL 菌液加入到900 μL 的生理盐水中，充分混匀后，从中取100 μL 加入到900 μL 的生理盐水中，充分混匀，依次稀释，使最终的稀释倍数为1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后各取菌液100 μL，均匀涂布到血液营养琼脂平板上，每个梯度重复3 次，置于37 ℃恒温过夜培养，48 h 后计数平板菌落数，有效计数为每个平板20～300 个菌落。做细菌活体计数，观察化脓隐秘杆菌HJ-1 型生长状况并绘制该菌株的生长曲线。

1.2.4 化脓隐秘杆菌HJ-1 型感染小鼠半数致死的测定

根据预实验，使用生理盐水将化脓隐秘杆菌菌液分别稀释到1.84×109，1.47×109，1.17×109，9.4×108，7.53×108，6.02×108，4.8×108，3.84×108，3×108，2.4×108，1.92×108，1.53×108cfu 等浓度，并接种小鼠腹腔注射，将小鼠随机分成13 组，每组10 只小鼠，其中1～12组为感染组，第13 组为对照组注射等量的生理盐水。根据改进的寇氏法[11]计算出化脓隐秘杆菌HJ-1型的半数致死量（LD50）。

2 结果

2.1 化脓隐秘杆菌HJ-1 型培养

将化脓隐秘杆菌HJ-1 型菌株接种于血液营养固体培养基，38 ℃恒温培养48 h，可见针尖样，透明菌落，菌落直径约1 mm，并有β-溶血环（图1）。5%血清BHI 液体培养基，37 ℃80 rpm 培养38 h 液体浑浊，出现絮状沉淀（图2）。

2.2 化脓隐秘杆菌HJ-1 型生化鉴定

（1）细菌纯培养后经过革兰氏染色，使用显微镜油镜观察可见，大量革兰氏阳性菌，多数为微弯曲短杆状，呈v 字型，短杆状，无芽孢，无荚膜，无鞭毛（图3）。

（2）对菌液进行生化鉴定结果（表1），符合化脓隐秘杆菌生化特性[4]，鉴定结果显示该菌株为化脓隐秘杆菌。

图1 化脓隐秘杆菌接种血液营养琼脂平板Fig.1 Colonies of T.pyogenes on blood agar medium

图2 化脓隐秘杆菌接种BHI 液体培养基Fig.2 T.pyogenes in serum BHI and formed moderate turbid

图3 化脓隐秘杆菌HJ-1 革兰氏染色结果（1 000×）Fig.3 Gram staining of T.pyogenes type HJ-1（1 000×）

表1 化脓隐秘杆菌HJ-1 生化鉴定结果Table 1 Results of biochemistry identification of HJ-1 isolated stained

表2 化脓隐秘杆菌细菌计数Table 2 The result of T.pyogenes count

2.3 化脓隐秘杆菌HJ-1 细菌计数及生长曲线的测定

根据（表1）显示表明：化脓隐秘杆菌HJ-1 型在37 ℃恒温摇床培养0～4 h 细菌生长缓慢从8 h 开始细菌快速生长，12～14 h 为化脓隐秘杆菌HJ-1 型的对数生长期，生长至22 h 细菌生长至高峰，此时的OD600值为0.81，菌落数为6.4×1011cfu（表2），之后化脓隐秘杆菌HJ-1 型进入平台期（图4）。

2.4 化脓隐秘杆菌HJ-1 型感染小鼠半数致死量测定

实验组前期已经测定，化脓隐秘杆菌HJ-1 型感染小鼠最大致死量（Dm）为1.84×109cfu，逐步降低攻毒计量，直到测的小鼠未发生死亡的感染计量。并测定了该株化脓隐秘杆菌感染小鼠最低致死量（Dn）为1.53×108cfu，根据改进寇氏算法计算出化脓隐秘杆菌HJ-1 感染小鼠的半数致死量，结果见（表3）。

图4 化脓隐秘杆菌HJ-1 型生长曲线Fig.4 Curve of T.pyogenes type HJ-1 plotted

表3 化脓隐秘杆菌HJ-1 型感染小鼠半数致死量测定Table 3 The measure of median lethal dose in mice

根据公式：半数致死量公式logLD50=Xm-i（Σp-0.5）

测定HJ-1 型化脓隐秘杆菌半数致死量为：4.16×108cfu

3 讨论

随着近年来报道化脓隐秘感染动物的报道日渐增多，如张天天等[12]猪脓肿部位的脓汁细菌分离培养，鉴定出化脓隐秘杆菌。千国胜等[13]在种鸭糊弄性关节炎分离鉴定处化脓隐秘杆菌。刘明春等[14]在奶牛子宫内膜炎感染病料中分离鉴定处化脓隐秘杆菌。化脓隐秘杆菌已经对多种养殖业造成了严重的危害，并且严重的威胁了动物与人类的健康，目前化脓隐秘杆菌感染疾病的预防与控制体系尚不完善，给该病的治疗造成了很大困难[22]，因此，实验通过对化脓隐秘杆菌HJ-1 型生长曲线及半数致死量测定，给之后化脓隐秘杆菌的疫苗研发与特效治疗药物奠定基础。

生长曲线的测定在微生物学研究中有着重要的意义，细菌生长曲线可以直观的反映出细菌生长繁殖的规律并可以根据细菌生长规律可分为细菌的延迟期，对数生长期，细菌生长稳定期以及衰亡期四个阶段。测定细菌的生长曲线方法有很多，如比浊法，平板菌落计数法，称重质量法等，如谢小伟等[15]对猪链球菌2 型生长曲线的测定；靳国旺和蔡敏[16]对副猪嗜血杆菌生长曲线的测定；李丽等[17]对产氨短杆菌生长曲线的测定。实验相较于王璞[18]对化脓隐秘杆菌生长曲线的测定，增加了比浊法与平板计数法法相结合，测定细菌时间间隔更短等优势。

半数致死量使在规定时间内，通过一定的感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数死亡所需最小细菌数或毒素量。LD50使评价细菌毒力的重要参数之一，计算LD50的方法常用改进式寇法，具有操作简单，实验结果可靠等优势，如王蒙蒙等[19]粪肠球菌小鼠半数致死量的研究；柴春霞等[20]对猪乙型脑炎病毒SCYA201201 株感染小鼠半数致死量的研究；以及马婷婷等[21]猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及其毒力的测定都采用改进寇氏法进行半数致死量LD50的测定。实验测定化脓隐秘杆菌HJ-1 感染小鼠半数致死量为4.16×108cfu，与王璞[18]测定的化脓隐秘杆菌小鼠半数致死量LD50=2.01×109存在这一定差异可能由于菌株毒力差异与小鼠品种个体差异有关。

4 结论

测定了化脓隐秘杆菌HJ-1 的生长曲线，确定其对数生长期为12～14 h，处于该时期的菌活力最强，感染能力最好，用对数生长期的化脓隐秘杆菌进行感染具有更好的致病性。测定了化脓隐秘杆菌HJ-1型对小鼠的半数致死量LD50=4.16×108cfu。试验结果为以后研究化脓隐秘杆菌的致病力与对动物的接种试验提供了依据。