抗结核化合物的设计与合成

邹顺 段李平 许东芳 孙大志

摘  要： 针对日益突出的结核病（TB）药物耐药性问题，对抗结核药物进行了合理的修饰，以增强其结核病治疗的效果.以异烟肼（INH）为原料，与不同的异氰酸酯反应，成功制备了9种新型的不对称取代脲类化合物，这类脲桥结构对结核分枝杆菌（MTB）中的半胱氨酸合酶具有抑制作用，合成的产物经质谱（MS）、氢核磁共振谱（1H NMR）等方法进行了分析表征.

关键词： 抗结核; 半胱氨酸合酶; 脲桥; 合成

中图分类号： O 625.67    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2020）04-0416-06

Abstract： In view of the increasingly prominent drug resistance of tuberculosis （TB） drugs，the rational structure modification of antituberculosis drugs can improve the efficacy of TB treatment.In this paper，nine novel asymmetric substituted ureas were successfully prepared by reacting isoniazid（INH） with different isocyanates.This kind of urea bridge structure has inhibitory effect on cystine synthase in mycobacterium tuberculosis（MTB）.The synthesized products were confirmed by mass spectrometry（MS） and nuclear magnetic resonance spectroscopy（1H NMR）.

Key words： antituberculosis; cysteine synthase; urea bridge; synthesis

0  引  言

结核病（TB）是一种感染了结核分枝杆菌（MTB）所引起的一种慢性传染病，它严重危害着人类健康，素有“白色瘟疫”之称[1-2].目前，世界卫生组织宣布TB不仅是一个全球性的公共卫生问题，也是严重的社会、经济和政治问题[3].TB已经成为继艾滋病及缺血性心脏病后，导致发展中国家成年人病死率较高的又一原因[4].根据全球各国的TB疫情状况，2015年10月WHO重新修订了全球TB高负担国家名单，中国是30个高负担国家之一[5].

随着各类临床常用药物的使用，MTB的耐药性也在不断提高，这就为未来治疗埋下了隐患，甚至对目前的一些治疗情况造成了影响[6].耐多药肺结核患者与普通肺结核患者相比，一是传染危害更大，受感染者一旦发病即为原发耐多药肺结核，且传染期更长;二是治疗费用更高，耐多药/广泛耐药肺结核（XDR-TB）的治疗需要二线抗结核药物，治疗时间长达2～3年之久，治疗费用大约是普通肺结核的100倍[7].尽管异烟肼（INH）的耐药性问题日益严重，但通过对该化合物进行合理的修饰，或许会得到对药敏型和耐药型的MTB，尤其是对XDR-TB均有效的新型抗TB药物.因此，近年来药物化学家对这类化合物一直进行着广泛的研究[8].

随着MTB标准菌株基因测序工作完成，蛋白质组学（Pro-teomics）已成为MTB功能基因组学研究的重要方法[9].ZONG等[10]通过比较XDR-TB临床分离株与标准菌株MTB（H37Rv）蛋白表达的差异，得出潜在临床药物作用靶点的3个蛋白质：ATP依赖性假定蛋白Rv2623、半胱氨酸合酶和蛋白酶体.其中针对半胱氨酸合酶，BRUNNER等[11]发现N，N′-双取代脲这类化合物能在一定程度上抑制半胱氨酸合酶的活性.

故本文作者采用INH为母体，与芳香异氰酸酯化合生成含有N，N′-双取代脲这类结构的化合物，根据不同取代基修饰的芳香异氰酸酯，得到不同取代基修饰的目标化合物，如图1所示.目标化合物具有N，N′-双取代脲这类结构，对XDR-TB具有一定的抑制作用，在体内水解后生成INH，对H37Rv具有抑制作用，故目标化合物应是一种对普通TB与耐药TB均有效的抗结核化合物.目标化合物结构由液相色谱-质谱（LC-MS）和氢核磁共振谱（1H NMR）检测表征.

1  材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

乙腈（CH3CN）、無水乙醇，上海凌峰化学试剂有限公司;二氯甲烷、石油醚，上海润捷化学试剂有限公司;INH、对甲苯异氰酸酯、对三氟甲基苯异氰酸酯、对甲氧基苯异氰酸酯、异氰酸酯对氟苯、对氯苯异氰酸酯、对溴苯异氰酸酯、3，4-二氯苯异氰酸酯、3，5-二氯苯异氰酸酯、3-吡啶异氰酸酯，国药集团化学试剂有限公司.实验合成所用主要试剂均为市售分析纯级别，未经纯化直接使用.

恒温磁力搅拌器（驰久85-2），上海闵行虹浦仪器厂;手提式紫外分析仪（2FP），上海康禾光电仪器有限公司;熔点测定仪（B-540）、旋转蒸发仪（R-300），瑞士步琪有限公司;分析天平（BSA224S），德国赛多利斯集团;质谱仪（LCQ Deca），美国Thermo公司;电子天平 （JA2003N），上海精密科学仪器有限公司.

1.2 目标化合物的合成及实验现象

目标化合物的合成采用化学实验合成法.在100 mL干燥的圆底烧瓶中，加入30 mL的乙腈及1.0 g的INH，充分摇荡后，在恒温磁力搅拌器上油浴加热冷凝回流1～2 h.当INH完全溶解后，称量1.0～2.0 g的不同芳基的异氰酸酯（ 加入的物质的量稍多于INH），并缓慢滴加至圆底烧瓶中，反应过程中观察实验现象并记录.滴加完毕后继续油浴加热回流1～2 h，待溶液冷却后，抽滤并用乙腈洗涤，烘干称量，即得到目标化合物，并用熔点测定仪测量其熔点.加入不同芳基的异氰酸酯，得到产物a～h;当芳基取代基为吡啶（即3-吡啶异氰酸酯）时，得到产物i，如表1所示.根据反应物的不同，实验现象也各不相同，如表2所示，产物产率都在70%以上，反应较为完全.

1.3 目标化合物的表征

1.3.1 MS的测定

MS由Thermo LCQ Deca 质谱仪测定.接通氮气（N2）和氩气（Ar），设定N2为7×105 Pa.检查电源并打开仪器，待质谱仪自检后，选择Masslynx软件中的离子模式.先注入调节仪器的标准样品，调节灵敏度和分辨率后，进行样品测定.

1.3.2 1H NMR的测定

首先进行样品的制备，在核磁共振样品管中放入2～5 mg样品，并加入0.5 mL氘代氯仿及1～2滴四甲基硅烷（TMS），进行测谱，将含样品的核磁共振管置入核磁共振仪中，测定1H NMR谱图.

2  分析与讨论

2.1 LC-MS分析

产物经LC分离后得以纯化，以纯物质形式进入质谱仪，可以充分发挥质谱法的特长，通过MS图中最高的分子离子峰的质荷比与目标产物的相对分子质量比较，可以初步判定产物是否为目标产物.同样根据LC图的出峰数和各峰面积比可以知道产物的纯度.

以产物a为例，结果如图2所示.设计的目标化合物a的相对分子质量为270.26，根据MS图（图2）所示，MS所测样品的分子离子峰的质荷比约为271.12，分子离子峰的质荷比与目标产物的相对分子质量基本相一致.即可初步证明产物即为目标化合物a.根据LC图（图3）所示，所合成产物纯度较高，杂质峰较少，且杂质峰面积较小.

依据此方法分析其他产物的LC-MS结果，所测所有产物样品的分子离子峰的质荷比与目标产物的相对分子质量基本都一致，即可初步证明产物即为目标化合物.除产物g，h和i，其他所合成产物纯度较高，杂质峰较少，且杂质峰面积较小.产物g，h和i需进一步纯化降低杂质含量，以排除杂质对药效的影响.

2.2 1H NMR分析

以产物a为例，分析1H NMR谱图信息（400 MHz，DMSO-d6），化学位移（δ）为10.66～10.49 （m，1H），8.81 （s，1H），8.79～8.72 （m，2H），8.26 （s，1H），7.88～7.75 （m，2H），7.41～7.29 （m，2H），7.12～7.01 （m，2H），2.23 （s，3H）.根据产物a的1H NMR图谱信息，在δ为2.3处谱图积分为3，对应设计目标化合物a中苯环上的甲基氢，在δ为7.12～7.01处积分为2，对应苯环上靠近甲基的2个氢，因为苯环上的H的δ在7～8，当与供电子基-CH3连接时，电子云密度增大，δ较小，δ为7.41～7.29应为苯环上另2个氢.而相应地，吡啶环上的N可视为强吸电子基，使δ偏大，δ为8.79～8.72处积分为2的2个氢是吡啶环上靠近N原子的2个氢，在δ为7.88～7.75处积分为2的2个氢则是吡啶环上另2个氢.δ为10.66～10.49，8.81及8.26处，积分均为1，对应目标化合物上脲桥的3个亚氨基上的氢.

综合产物a的1H NMR谱图信息和2.1节MS信息所得结论，可以确定所得产物即为设计目标化合物a.依此分析其他产物，可以确定所有所得產物均为目标化合物.

2.3 生物活性测试

在本研究中不作生物活性的详细介绍，另在其他文献中进行了药物活性实验的分析详解.药物活性实验结果显示本次合成的9种药物均有着不亚于常用药物的药效，需进一步探究临床效用.

3  结  论

本实验得到的INH衍生化合物是INH与一系列异氰酸酯反应生成的不对称取代脲类化合物.INH作为抗肺结核药物已有50多年的历史，仍具有良好的生物活性，但是抗药性的产生无疑是一个亟需解决的问题.因此，近几十年来，对INH及其衍生物的合成与应用研究从未间断.在抗药结核杆菌与标准结核杆菌之间的蛋白质差异中发现半胱氨酸合酶这一潜在的靶点，因此，本课题在现有INH药物的基础上，在其有效位点上进行结构优化和改进，合成了9种新型的N，N′-双取代的脲类化合物.合成的产物通过熔点测定、MS、1H NMR等手段表征，表明产物即为所设计的目标化合物.合成的目标化合物在生物活性上不亚于常用药物，并且合成转化率较高.

参考文献：

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（责任编辑：郁慧，包震宇）