甘蔗CP84-1198×ROC22杂交群体抗褐锈病Bru1基因分子检测

陈兴龙，谢锦芳，巫 彬，冯晓敏，黄咏虹，高小宁，刘 睿，吴嘉云，陈骏佳，齐永文*

(1广东省科学院生物工程研究所，广东广州510316；2仲恺农业工程学院农业与生物工程学院，广东广州510225)

0 前言

甘蔗(Saccharum spp.)是我国最主要的糖料作物，种植面积约为 110.85万 hm2[1]。ROC22在 20多年来一直是我国主导品种，种植面积最大，2014～2019年累计种植面积达315.60万hm2[1]。该品种为台湾甘蔗研究所育成，母本为ROC5，父本为69-463，该品种的特征特性为：中茎至大茎，且蔗茎均匀，茎皮遮光部分浅黄绿色，露光部分紫红色，芽呈卵圆形。57号毛群较发达，萌芽良好，分蘖力强，初期生长稍慢，中后期生长快速，原料蔗茎长，茎数中等，易脱叶，甘蔗基部粗大，不易倒伏，耐旱力强，抗褐锈病(含Bru1基因)等[2-3]。近几年因宿根性差、不适宜机械化、感黑穗病等因素，种植面积逐步减少[1]。利用国外引进的品种为杂交亲本选配组合，是拓宽甘蔗育种的遗传基础、促进品种改良的重要途径。CP84-1198是由美国农业部运河点甘蔗育种场育成，因为宿根性好，高糖等优点，受到我国育种家的高度关注。为了更好的改良ROC22，本研究以ROC22为父本，CP84-1198为母本配制杂交组合，期望找到性状优良的杂交后代。

由黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephalaH.Sydow & P. Sydow)引起的甘蔗褐锈病是甘蔗上产上重要的叶部病害，可引起严重的产量和糖分损失[4]。目前，该病害在爪哇、古巴、牙买加、美国、澳大利亚、墨西哥、泰国、毛里求斯、中国等甘蔗种植国家和地区都有发生，已经发展成为一种世界性的甘蔗病害[5]。培育抗锈病的品种是防治该病害最为经济有效的方法。Asnaghi等[6]在甘蔗栽培种 R570上发现了一个对世界各个地区的褐锈病柄锈菌都具有广谱抗性主效抗性基因Bru1。Costet等[8]通过对R570抗褐锈病遗传机制的系列研究，开发出了2个与该基因紧密连锁的分子标记R12H16和9O20-F4。此后这2个标记被广泛应用于甘蔗褐锈病的抗病育种研究当中，特别是对甘蔗核心亲本和其他重要科研材料的筛选[6-9]。而对于杂交后代分离群体抗褐锈病基因个体的遴选鲜有报道。在选育实生苗阶段对杂交群体进行目标基因的检测，有利于实现早代选择，大幅度提高育种效率，降低育种成本，提升育种进程。

R12H16和 9O20-F4在甘蔗褐锈病抗性分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)中具有重要作用。Costet等[8]用这2个标记对380份甘蔗材料进行Bru1基因的检测，发现这2个标记完全相关。李文凤等[9]通过对 101份主要育种亲本进行分子检测，2个分子标记重复检测结果一致。端木卜文等[10]通过对164份国内外甘蔗种质材料进行Bru1基因的检测，也发现这2个分子标记检测到的结果完全一样。因此，本研究选取其中的标记 R12H16对CP84-1198×ROC22杂交群体进行Bru1基因分子检测，分析杂交后代群体中Bru1基因的分布，为后续抗甘蔗褐锈病的研究提供材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

母本：CP84-1198，父本：ROC22，父母本的花穗杂交授粉委托广东省科学院生物工程研究所海南甘蔗育种场进行，1100个杂交后代实生苗种植于广东省科学院生物工程研究所的韶关市翁源基地。田间管理与常规生产操作一致。

R570：已知含有甘蔗褐锈病抗性基因Bru1，保育在本课题组的资源圃。

主要仪器：Vortex Shaker振荡器(QL-861，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；BioPhotometer 核酸蛋白测定仪(D30，德国艾本德股份公司)；PCR仪(TC-XP，杭州博日科技有限公司)；凝胶成像系统(Gel Doc XR+，美国伯乐公司)。

主要试剂：CTAB (Hexadecyltrimethylammon--ium Bromide)、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、Pro Taq预混液、琼脂糖凝胶、核酸染料GoldView。

1.2 甘蔗基因组DNA提取

随机挑取 280个株系苗期的新鲜嫩叶，采用CTAB的方法提取甘蔗基因组DNA。具体步骤如：称取1 g的嫩叶剪碎放于研钵中，用液氮研磨至粉末，装入 2 mL离心管中，并加入 650 µL的 2×CTAB；混匀后置于65℃水浴锅45 min，每隔15 min上下颠倒混匀一次；待管内溶液降至室温后加入650µL的氯仿∶异戊醇(24∶1)，仪器剧烈混匀，10000 r/min 离心10 min；取600 µL上清液于新的离心管中，加入600 µL的氯仿∶异戊醇(24∶1)，仪器剧烈混匀，10000 r/min离心10 min；取500 µL上清液于新的离心管中，加入1000 µL的异丙醇，上下颠倒混匀，可以观察到棉絮状 DNA，放置-20℃下沉淀30 min以上；10000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用500 µL 75%乙醇洗涤2遍，离心5 min，风机抽干10 min；溶解于100 µL TE缓冲液或者无菌水中，于分光光度计下测量 DNA浓度并记录，用TE缓冲液或ddH2O稀释至所要的浓度或保存于-20℃冰箱。

1.3 引物的合成

参照梅志鹏等[11]的引物，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司广州合成部合成，引物R12H16扩增 570 bp片段：Forward：5’-CTACGATGAAACTACACCCTTGTC-3’，Reverse：5’-CTTATGTTAGCGTGACCTATGGTC-3’。

1.4 PCR扩增

以品种 R570为阳性对照，提取的 280份CP84-1198×ROC22杂交群体各个株系的DNA为反应体系的模板，用R12H16引物进行PCR扩增。扩增反应总体系为20 µL PCR反应体系：ddH2O，6.5µL；Primer各 0.5 µL；2×Pro Taq 预混液 10 µL；DNA 2.5 µL。PCR反应程序为：95℃预变性10 min，94℃变性35 s，56℃退火35 s，72℃延伸40 s，36个循环，延伸72℃ 10 min，4℃保存。

1.5 琼脂糖凝胶电泳

将R12H16标记PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：先把 1.5%琼脂糖凝胶(1×TE)煮沸溶解(80 mL TE+5 µL GoldView)，冷却到 65℃左右导入插好梳子的制胶槽，混匀 10 µL PCR产物(已含染料)，加入琼脂糖凝胶孔上，80 V电压下，由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，当产物跑到边缘1 cm之前停止电泳，在紫外灯下观察，采用凝胶成像系统拍照保存。

1.6 数据分析

根据孟德尔分离定律，只有当 ROC22的Bru1位点上含有单个抗性等位基因，另一个亲本CP84-1198的Bru1位点上不含有抗性等位基因，其杂交F1后代才会出现1∶1的分离比，类似于2倍体中的测交试验。如果ROC22的Bru1位点上含有2个抗性等位基因，跟不含 Bru1抗性基因的CP84-1198杂交 F1后代就会出现 2(抗)∶1(感)的分离比，以此类推。

卡方检验：假设CP84-1198×ROC22杂交群体中含有和不含有抗锈病Bru1基因个体分离符合1∶1 的比率，水平 α=0.05 (χ2=3.84)，自由度df=k-1=1(k=2)，含有抗锈病Bru1基因的理论个体数为：Ei=280×1/2=140，不含有抗锈病 Bru1基因的理论个体数为：Ei=280×1/2=140。

2 结果与分析

2.1 甘蔗CP84-1198×ROC22杂交群体构建

以CP84-1198为母本，为ROC22父本，委托广东省科学院生物工程研究所海南甘蔗育种场进行父母本的花穗杂交授粉，获得1100个杂交后代，经由本实验室温室育苗并把实生苗移栽种植到广东省韶关市翁源基地(见图1)。

2.2 甘蔗 CP84-1198×ROC22杂交群体锈病抗性基因Bru1检测

图1 甘蔗CP84-1198×ROC22杂交群体田间图

从1100个杂交后代的实生苗中挑取280个株系组成一个分离群体。并对该群体进行锈病抗性基因Bru1的PCR检测。以R12H16标记引物对280个株系的DNA进行PCR扩增，部分结果如图2所示，泳道0是阴性对照，未能扩增出条带，泳道R代表的R570和泳道R2代表的亲本ROC22在570 bp处都能够稳定扩增出一条特异性的目标条带，而泳道CP所代表的亲本CP84-1198则不能扩增出条带，泳道 6、7、13、22、35、66、74、83、90分别代表该群体编号为 6、7、13、22、35、66、74、83、90的样品，也能够扩增出清晰的条带。挑选泳道6、7、22、35、83、90个样本的扩增产物进行单向测序，测序比对结果如如图3所示，除了引物开头(红色大框内)和结尾为570 bp处(红色小框内)没有全部比对上，其余碱基与R570和ROC22的Bru1(R12H16标记)碱基序列完全一致，表明含有 Bru1基因。图中条带颜色越深表示Bru1基因扩增产物含量越高，颜色越浅表示含量越低。而泳道12、20、21、36、55、56、67、75、82、91、94分别代表该群体编号为12、20、21、36、55、56、67、75、82、91、94 的样品，都未能够扩增出特异条带，表示不含有Bru1基因。

图2 R12H16标记对CP84-1198×ROC22杂交群体样本褐锈病抗性基因Bru1的PCR扩增电泳图

图3 R12H16标记扩增序列比对结果

杂交群体中其它株系的扩增结果如表1所示，共有156个株系扩增出570 bp目标条带(阳性)，表明这些株系含Bru1基因，占供试材料的 55.71%，其余 124个株系均未能扩增出目标条带(阴性)，表明不含有Bru1基因，占供试材料的 44.29%。含有与不含有抗锈病Bru1基因的比例近似于 1∶1，卡方值χ2=3.43，小于3.84(自由度df=1时，P=0.05)，符合理论比，表明亲本ROC22含有单个抗锈病Bru1等位基因，而亲本CP84-1198不含有抗锈病Bru1等位基因。

表1 CP84-1198×ROC22杂交群体抗甘蔗褐锈病Bru1基因的PCR检测结果

3 讨论

在过去的20多年里ROC22是我国种植面积最大的品种，占据绝对的主导地位，但是近几年来因宿根性差、不适宜机械化、感病等因素，种植面积逐步减少[1]。CP84-1198具有宿根性好、高糖、抗病性好等优点，据此，本研究配制CP84-1198×ROC22杂交组合，分析杂交后代中褐锈病基因的分离，对于以 ROC22为基础进行品种改良以及新品系创制具有重要的意义。

甘蔗褐锈病已经慢慢成为了一种世界性的甘蔗病害[5]。而主效抗性基因Bru1对褐锈病柄锈菌具有广谱抗性，因此Bru1基因在甘蔗褐锈病的抗病育种中具有举足轻重的作用[7]。Costet等[8]开发的2个与Bru1基因紧密连锁的标记，大大加速了抗性基因的检测技术，并且运用到实际生产当中，如对甘蔗核心亲本和其他重要科研材料的检测[7,9]。本研究通过对CP84-1198×ROC22群体Bru1基因的检测也证实了该基因的分子标记辅助选择(MAS)可以运用杂交后代的快速选择。测序结果与 Wang等[12]的比对当中，由于本文只选择了单向测序所以在上游引物之后的碱基刚开始往往测的不是非常准确，难免有几个比对不上的碱基，测序结尾部分由于 Wang等的只测序了569 bp，而本文测序到570 bp，所以会多出一个碱基。本群体的亲本ROC22含有Bru1基因，而亲本CP84-1198不含有Bru1基因的结果与傅华英等[3]和李文凤等[9]的结果一致。CP84-1198×ROC22分离群体的检测结果中发现，杂交后代中含有与不含有抗锈病基因 Bru1符合理论比 1∶1，进一步验证亲本ROC22含有单个抗锈病Bru1等位基因，而亲本CP84-1198不含有抗锈病Bru1等位基因，对甘蔗褐锈病抗基因的遗传机制研究具有重要意义。此外，明确CP84-1198×ROC22杂交群体中各个株系抗甘蔗锈病Bru1基因的分布情况，可以为深入开展该群体抗褐锈病育种、选育和推广优良抗性品系提供材料基础。这也为利用分子标记辅助选择(MAS)抗病育种提供了有力的证据，在实生苗阶段通过选育具有目标基因的株系，能够在大量的甘蔗种质资源后代材料中快速、高效、准确地筛选抗病材料，实现早代选择，缩短抗病育种时间，大幅度提高育种效率，降低育种成本，加快育种进程。