姬美石斛快繁体系的建立

彭 杨，陈 朋，李 娜，杨蕾蕾

（深圳市中国科学院仙湖植物园，广东深圳 518004）

姬美石斛（Hibiki） 是以长苞石斛（Dendrobium bracteosum Rchb.f.）和亮叶石斛（D.laevifolium laevifolium Stapf）为亲本的石斛杂交种，其花期覆盖春、夏、秋三季，长达半年，并且花色艳丽，以持久的花期和可观的花量而受到兰花爱好者的广泛欢迎，是出色的园艺品种。姬美石斛近年来引进于泰国和日本，各大花市只能偶尔见到少量销售。

传统的石斛属植物主要通过分株和枝条扦插方式进行繁殖，不仅繁殖效率低下，而且所得种苗大小不一，难以达到市场要求标准。通过组织培养进行植株的再生，可以得到整齐且花期一致的种苗，目前组织培养技术已在铁皮石斛[1]、金钗石斛[2-3]和多种杂交的石斛品种[4-5]中得以应用。植物生长调节剂在石斛属植物组织培养中起到重要的作用，如TDZ 在澳洲鸽子石斛（D.kingianum Bidwill ex Lindl.）的组织培养过程中可以起到有效诱导类原球茎，并促进丛生芽增殖的作用[6]，而6-BA、NAA 和KT 的联合使用，对高山石斛（D.infundibulum Lindl.）的增殖具有良好的效果[7]。本试验以MS 为基础培养基，通过添加不同的植物生长调节剂和有机添加物，对姬美石斛的组织培养技术进行研究，以期获得高效率、低成本的规模化、标准化生产技术，为姬美石斛在市场上的广泛推广提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 植物材料

选取姬美石斛新生枝长2～3cm 的茎尖，0.1%升汞溶液消毒处理6min，无菌条件下去除茎尖上的叶片和包裹的叶鞘，无菌水冲洗4～6 次，获得外植体材料。

1.2 试验方法

1.2.1 植物生长调节剂对姬美石斛丛生芽增殖的影响。分析6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）和萘乙酸（NAA）对丛生芽的影响：以MS 为基本培养基，设置不同浓度的6-BA（0.2～2mg/L）与NAA（0.5mg/L）共组成5个处理（培养基编号为A1～A5，见表1），探究6-BA 对姬美石斛丛生芽增殖的影响；设置不同浓度的KT（0.2～2mg/L）与NAA（0.5mg/L）共组成5 个处理（培养基编号为B1～B5，见表1），探究KT 对姬美石斛丛生芽增殖的影响；设置不同浓度的NAA（0.1～1.5mg/L）与6-BA（1mg/L）共组成5 个处理（培养基编号为C1～C5，见表2），探究NAA 对姬美石斛的丛生芽增殖的影响。培养60d 后进行统计，筛选出最适丛生芽增殖的植物生长调节剂组合。

1.2.2 不同有机添加物对姬美石斛丛生芽增殖的影响。以添加了6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L 的MS 培养基为基础，分别添加30g/L 桃泥、椰汁、香蕉泥和苹果泥4种有机物，共组成5 个处理（培养基配方为D1～D5，见表3），探究有机添加物对姬美石斛丛生芽增殖的影响，培养60d 后进行统计，筛选出最适丛生芽增殖的有机添加物种类。

以上各培养基均添加30g/L 蔗糖、6g/L 琼脂粉，pH值调节至5.8～6.0 之间。培养温度为25±2℃，光照时间为16h，光照强度为37～40μmol/m2·s。

1.3 数据统计分析

增殖系数=新形成的芽数/接种时的芽数。

选取大小均匀、苗龄一致的姬美石斛芽，随机进行接种，每处理10 瓶，每瓶3 个单芽，重复3 次。方差分析采用SPSS 20.0 数据统计软件One-way ANOVG 方法进行，用LSD 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂对姬美石斛丛生芽增殖的影响

2.1.1 6-BA、KT 对姬美石斛丛生芽增殖的影响。在MS 培养基中添加不同浓度的6-BA 或KT 均能促进姬美石斛丛生芽的增殖（表1）。6-BA 浓度在0.2～1.0mg/L之间，植株丛生芽的增殖系数整体呈上升趋势，与6-BA 浓度呈正相关趋势，但在6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L 组合时，增殖系数低至1.67，而在2.0mg/L 6-BA 时又具有显著增殖效果。在MS 基本培养基中，不同浓度KT 的添加都具有显著增殖效果，并在其浓度相对较低（0.2mg/L）时，增殖系数最高。空白对照组中，增殖系数较小，植株细弱矮小，但其主根较为发达。

2.1.2 NAA 对姬美石斛丛生芽增殖的影响。在MS 基本培养基中添加6-BA 1.0mg/L 的条件下，添加浓度范围0.1～1.5mg/L 的NAA 都能明显地促进姬美石斛丛生芽的增殖。当NAA 浓度达到1.0mg/L 以上时，与空白对照组相比具有显著的增殖效果，在浓度达到1.5mg/L时，增殖系数最高，但植株的根部发生膨大，出现畸形。

根据以上15 组植物生长调节剂组合产生的增殖效果，结合植株生长状态综合判断，认为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA 的培养基为最适姬美石斛丛生芽增殖培养基。

2.2 有机添加物对姬美石斛增殖的影响

图1 丛生芽增殖与植株再生

在MS 基本培养基中添加桃泥、苹果泥和香蕉泥3种有机物，都对姬美石斛丛生芽增殖具有一定程度上促进作用，其增殖效果由强到弱依次为桃泥＞苹果泥＞香蕉泥，其中添加桃泥的培养基具有显著的增殖效果；苹果添加物能使其在生根数量上具有显著作用。椰汁的添加不仅不能起到促进作用，反而对姬美石斛的生长产生了一定的抑制，导致其增殖系数显著低于空白对照组，生长状态也不如空白对照组。

2.3 移栽

石斛类植物多是附生植物，喜欢通风透气，商品化培养多使用水苔、树皮和椰壳等基质于容器中进行。因此，将高约3cm 的植株植于湿润的水苔中炼苗，1 个月后移栽于直径约1cm 树皮基质中，置于阴凉通风处，温度保持18～25℃，湿度70%左右，成活率可达85%。

3 讨论

表1 6-BA 和KT 对丛生芽增殖的影响

表2 NAA 对丛生芽增殖的影响

表3 不同有机添加物对丛生芽增殖的影响

植物组织培养技术是实现快速繁殖同时也是保存母本性状的有效手段，常应用于濒危和珍稀物种的保育工作[8-9]，也是性状优良的园艺品种生产方式，尤其是在兰科植物的生产中广泛应用[10]。石斛是兰科植物中的重要组成类群，也是重要的园艺品种类群之一。石斛的组织培养通常使用嫩叶、茎尖等作为外植体，通过愈伤组织、类原球茎增殖或者丛生芽增殖的方式进行[11]。不同种类和浓度的植物生长调节剂在其增殖方式和增殖效率上都起着非常重要的作用。已有的研究表明，2,4-D 能够诱导澳洲鸽子石斛愈伤组织的产生，而6-BA 和TDZ 的不同浓度组合能够有效诱导其愈伤和类原球茎的增殖和分化[6]。愈伤组织或者类原球茎的增殖效率远远高于丛生芽的增殖方式，但在研究中发现，愈伤和类原球茎在增殖过程中容易发生较高的变异[12]，因此，在实际生产中通常采用丛生芽增殖的方式来保证园艺品种的优良性状。石斛属植物丛生芽增殖过程中多使用KT、6-BA 和NAA 3 种植物生长调节剂的组合，最适组合的浓度因不同的种或品种而有所差异，比如澳洲鸽子石斛丛生芽在KT 2.0mg/L 与NAA 0.5mg/L 组合下增殖系数最高[6]，翅萼石斛则为6-BA 1.0mg/L 与NAA 0.1mg/L[13]，也有在低细胞分裂素、高生长素的组合下最适丛生芽增殖的石斛品种[5]。本试验发现，6-BA 1.0mg/L 与NAA 1.0mg/L 组合最利于姬美石斛丛生芽的增殖，6-BA 浓度增高或者KT 的使用都会促进组培过程中高位芽的生长，NAA 过高的浓度则会引起根部膨大畸形。石斛高位芽的生长属于其自身的营养繁殖方式[14]，不利于丛生芽的快速增殖，推测可能是受到过高浓度植物生长调节剂的胁迫而发生的现象。

兰科植物组织培养过程中经常加入多样的添加物促进原球茎或丛生芽的快速增殖[15]。这些添加物中因含有不同的植物生长调节剂或氨基酸等物质，对植物组织的增殖具有不同的效果，比如椰汁中因含有细胞分裂素（CK，cytokinins）能够刺激原球茎或类原球茎的形成和增殖，同时也对芽和叶片的形成具有一定的影响[16]。苹果泥、香蕉泥和土豆泥也常作添加物使用，在澳洲鸽子石斛组培中发现，香蕉、椰汁、土豆的添加有助于植株长高，而苹果和土豆的添加能够使茎增粗[6]。本试验研究发现，桃泥和苹果泥的添加能够促进丛生芽的增殖，并且苹果添加物对生根的促进作用明显。

姬美石斛的炼苗和移栽养护过程要注意栽培基质的含水量和空气湿度以及温度的控制，通常在温度保持18～25℃，湿度70%左右的条件下即可正常生长。