多羔主效FecB基因在济宁青山羊中的检测与分析

张圆，黄晓晨，高一珊，康贝宁，李增宽，赵勇，闵令江

（1.济宁市畜牧业发展中心，山东 济宁 272000；2.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

我国地方羊种类多样。济宁青山羊是我国典型的地方品种，原产于山东省济宁市和菏泽市的各个县区。外貌特征通常被定义为“四青一黑”，青色可以根据黑白毛的比例再次划分为三种毛色，即正青色、粉青色和铁青色，其中正青色最常见［1］。

繁殖力高是济宁青山羊的显著特点。根据《中国羊品种志》记载，在我国各种地方羊品种中，济宁青山羊的繁殖力最高，大多数地方品种繁殖力较低［2］。济宁青山羊一直以多胎高产、常年发情、全年可配种、适应性强、羔皮质量好而出名。母羊年产两胎或两年三胎，普通山羊排卵数一般为2～3个，济宁青山羊可达5个以上，平均窝产仔数2.94只，高产者可达6～7只［3］。研究发现，济宁青山羊每胎的产羔数随着胎次的增加而增加，直到第四胎或第五胎达到产羔数的高峰期［4］。

FecB基因最初在布鲁拉美利奴羊中发现，后证实该基因的确存在且能影响绵羊排卵率和繁殖力，1989年正式被绵、山羊遗传命名委员会命名为FecB基因［5］。FecB基因是一个高繁殖力主效基因，由BMPR-IB基因编码区的第746 bp发生A→G的碱基突变而形成。自FecB基因发现以来，研究人员针对该基因展开了分析研究。母羊若发生FecB基因突变，会影响与之识别的配体GDF-5和BMP-4对类固醇生成作用的反应，削弱对颗粒细胞的抑制作用，促进卵泡加快成熟以及增加排卵数［6］。FecB基因对排卵率的影响是加性的，携带一个拷贝基因的排卵率为1.3～1.6，携带两个为2.7～3.0［7］。柳淑芳等［8］研究发现，FecB基因能大大提高母羊的发情率，增强繁殖性能，一般非多胎性品种在非繁殖性季节的发情率极低，大约为20% ～30%，而携带FecB基因的母羊不仅能一年四季都发情，而且在非繁殖性季节，发情率也不低于60%。

PCR-RFLP技术作为一种DNA分子标记技术，与传统RFLP标记相比，具有不需要克隆基因作探针，不依赖Southern blot技术的优点，而且方法简便，分型时间短，逐渐用于动物育种中［9］。王根林等［10］以湖羊和小尾寒羊为研究对象，运用PCR-RFLP技术在两种羊中均检测出了FecB基因。马丽娜等［11］在373只滩羊上利用TaqMan探针对FecB基因进行SNP分型研究，共发现三种基因型，对比其产羔数发现FecB基因能有效提高繁殖力，可通过基因型选育加快多羔品系的培育。刘铮铸等［12］采用PCR-RFLP技术分析山羊MyoG基因的多态性，利用限制性核酸内切酶Csp6Ⅰ对山羊MyoG基因的扩增产物进行酶切，结果发现山羊MyoG内含子二区域存在多态性。

自FecB基因发现以来，大量研究报道了该基因与绵羊的相关性，而对山羊的研究较少。本试验以济宁青山羊为研究对象，应用PCR-RFLP方法对济宁青山羊FecB基因进行检测，并与产羔数进行关联分析，从而探究青山羊多胎性机理，为降低济宁青山羊育种成本、加快品种选育进度提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 本试验所用济宁青山羊全部来自山东省济宁青山羊原种场，通过查阅系谱档案材料，选取连续三胎均产三羔或三羔以上的济宁青山羊14只，连续三胎均产单羔的济宁青山羊12只。选取的26只济宁青山羊年龄、体重基本一致。

1.1.2 主要试剂 Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］；AvaⅡ限制性内切酶、10×NEBuffer［NEB（北京）有限公司］；琼脂糖干粉电泳缓冲液（1×TAE）、电泳上样缓冲液（10×Loading Buffer）、核酸染料、2×Phanta Max Master Mix（南京诺唯赞医疗科技有限公司）。

1.1.3 主要器材 金属浴（南京沃拓仪器设备有限公司）；高速离心机（Eppendorf生命科学公司）；匀浆机（德国IKA公司）；超微量分光光度计（上海美谷分子仪器有限公司）；PCR仪器（北京友华照钦医疗器械有限公司）；超低温冰箱（海尔集团有限公司）；DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；凝胶成像系统（北京科创锐新生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 对26只济宁青山羊进行同期发情处理，撤栓后次日进行统一屠宰并收集完整子宫，在子宫相同位置取花生仁大小组织块，迅速放入液氮中，于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2.2 样品DNA提取 基因组DNA提取和测定等均参照Sambrook等［13］的方法，将提取的DNA于-20℃冰箱保存。

1.2.3 DNA纯度与浓度检测 利用DNA浓度纯度测定仪测量浓度和纯度，检测其是否符合标准。

1.2.4 PCR扩增 参照李星星等［14］的研究设计引物（F：5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3′，P：5′-CAAGATGTTTTCATGCCTATCAACACGGTC-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，预计扩增产物大小为140 bp。

PCR反应体系（20μL）：DNA 2.0μL，上下游引物（10μmol／L）各0.8μL，2 ×Phanta Max Master Mix 10.0μL，ddH2O 6.4μL。PCR反应程序：95℃30 s；95℃15 s，50℃15 s，72℃30 s，共35个循环；72℃5 min，-20℃保存。

PCR反应产物采用3%琼脂糖凝胶电泳（220 V，100 mA，20 min）进行检测，并于凝胶成像仪中拍照保存。

1.2.5 酶切试验 用限制性内切酶AvaⅡ对上述PCR产物进行酶切，酶切体系（50μL）：PCR扩增产物1μL，10×NEBuffer 5μL，AvaⅡ酶1μL，ddH2O 43μL。将配制好的样品于37℃水浴锅中酶解30 min。采用3%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 样品DNA纯度检测

纯的DNA样品中OD260／OD230值应在2.0～2.5之间，OD230是某些有机试剂和多糖的吸收峰，若比值小于2.0，说明溶液中有多糖或有机试剂污染。OD260／OD280值在1.8～2.0范围内说明核酸纯度较高；如果大于2.0，则表明产物中有RNA污染；若低于1.8，则表明产物中有蛋白质、酚等污染。上述样品中除了H3和L6不符合需求之外（表1），其他样品均可用于下一步试验。

表1 样品DNA浓度和纯度

2.2 PCR扩增产物检测

如图1所示，扩增条带大小约140 bp，与预期扩增片段大小一致，条带均匀、清晰明亮且无其他杂带，说明扩增片段特异性良好，可用来进行后续试验。

2.3 PCR-RFLP电泳结果

根据李东红等［15］的研究，当BMPR-IB基因的746 bp处发生A→G突变时，便会形成FecB基因并产生AvaⅡ酶的酶切位点，因此对PCR产物进行酶切后，会产生大小为110 bp和30 bp的片段；若没有发生突变，对PCR产物进行酶切后，只有140 bp一条带。由于不同个体间存在不同的基因型，所以对PCR产物进行限制性酶切后，理论上凝胶电泳会出现三种情况：第一种是存在突变位点，凝胶电泳结果出现两条带，其大小分别为110 bp和30 bp，则称该基因型为纯合突变型（BB）；第二种是只存在一个突变位点，凝胶电泳结果出现30、110 bp和140 bp三条带，即一条链被限制性内切酶切开，另一条没有突变位点，该基因型为杂合型（B＋）；第三种是酶切后只有一条带（140 bp），即不存在突变，故没有限制性内切酶酶切位点，此基因型被称为野生型（＋＋）。本试验并未在济宁青山羊中检测到A746G的突变，用AvaⅡ限制性内切酶对PCR产物酶切后，所有样品都表现为整齐的一条带（图2）。

3 讨论与结论

FecB基因是发现较早的一个与繁殖力相关的基因。Fogarty［16］对布鲁拉美利奴羊FecB基因纯合子（BB）、杂合子（B＋）和非携带者（＋＋）基因型进行比较，发现携带一个FecB基因（B＋）的母羊排卵率为1.3（0.8～2.0），产仔数为0.7（0.4～1.3），该基因对排卵率的影响一般是加性的，纯合基因型（BB）的母羊产仔数会进一步增加。刘永斌等［17］研究发现，繁殖力较高的中国美利奴羊与布鲁拉美利奴羊均产生了FecB基因突变，而繁殖力低的呼伦贝尔羊、内蒙古细毛羊和蒙古羊并没有发现此突变。韩颖洁等［18］对600只小尾寒羊进行PCR-RFLP分析，发现存在FecB基因突变位点，并出现三种情况：一条片段（＋＋），两条片段（BB）和三条片段（B＋），对其中100只羊的产羔数进行分析，发现BB基因型的平均产羔数最多，其次是B＋型，＋＋型的产羔数最少，由此说明FecB基因是提高小尾寒羊繁殖力的有利基因。候广田等［19］以小尾寒羊和其与多浪羊、德国美利奴羊、萨福克羊的杂交F1代为研究对象，分析不同绵羊群体中FecB基因的多态性，发现小尾寒羊与德国美利奴羊和萨福克羊的杂交后代都存在杂合基因型（B＋），表明这两个杂交群体已成功引入多胎基因FecB，因此以小尾寒羊作为亲代，对于改善子代的繁殖性能有积极作用。

本试验酶切结果显示只有一条140 bp大小的片段，原因可能为：第一，济宁青山羊不存在A746G突变，所以限制性内切酶不能将其切开；第二，由于时间、条件有限，样品数目太少，可能这批样品正好没有多态性，即都是野生型（＋＋）；第三，进行酶切时需要严格的试验条件，可能是酶切体系、加热时间或温度等设置不当，导致酶切失败。因此，济宁青山羊多胎高产的性能是否与FecB基因有关仍然有待研究。朱兰等［20］以云南黑山羊和龙陵黄山羊为研究对象，并运用PCRSSCP与测序相结合的技术对FecB基因进行检测，结果在这两种羊中也没有发现FecB基因。

FecB基因虽然能有效提高产仔数、增强繁殖力，但胚胎成活率和断奶重却有所下降。曹阳等［21］发现有FecB基因突变的母羊胚胎死亡率增加15%左右，且生产性能较差。由此可见，FecB基因的存在并不是只有益处。这就要求我们在培育多胎品种、追求高繁殖力的同时，也要注意出生重、胚胎成活率、断奶后的生长状况等一些质的保证，严格制定科学合理的育种计划，保证质和量的双丰收。

济宁青山羊作为皮肉兼用的代表性品种，具有较大的市场价值，因此对其繁殖力机制，特别是控制多胎性状主效基因的研究和利用十分重要。利用筛选出的基因对济宁青山羊进行辅助育种，不仅能大大提高选育速度、节约时间，而且还能减少生产成本、提高经济效益。虽然济宁青山羊是皮肉兼用，但其产肉率比较低，可以通过杂交提高产肉率，但杂交后产羔率又会下降，故希望能有效利用基因检测技术，将肉用和高产结合起来，既能解决产肉率又能解决产羔率问题，从而使养殖业实现成本最小化、效益最大化。PCR-RFLP技术在动物育种方面被广泛利用，能有效、简便地检测基因多态性，然而该技术也存在一些不足之处，如检测的多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数目，酶切条件十分严格等。相信随着科学技术的发展和进步，各研究方法和技术都将不断提高和完善。