洋葱花梗愈伤诱导及再生体系的建立

惠林冲，陈微，李威亚，潘美红，何林玉，王江英，陈振泰，缪美华，杨海峰

（连云港市农业科学院，江苏 连云港 222000）

洋葱愈伤组织的诱导、再生与外植体的选择关系密切。研究发现，洋葱的种子［1］、成熟胚［2］、鳞茎盘［3］、胚根［4］等均可作为外植体诱导形成愈伤组织，但部分诱导出的愈伤组织不能形成再生苗。Valk等［5］认为洋葱愈伤组织诱导受基因型影响，因此，诱导时需要对多种材料进行筛选，综合考虑外植体类型、污染率、消毒操作难易程度等。

我国的经济正在进入深化改革的阶段，社会资源的供需矛盾正在加剧。最明显的问题就是社会利益分配不均。由于法律制度存在滞后性，而我国的发展速度非常快，造成了法律法规的建设无法跟上社会的发展速度。普遍存在的问题是对权利的监督不完善，导致社会不公平的问题较多，影响青少年价值观的形成。需要加快社会保障制度的完善，提高法律法规的规范化，做到有法可依和有法必依。

洋葱种子易保存，但存在种子污染率较高、后期需要转接胚以及操作繁琐且不适宜大规模筛选操作等问题。目前，中国水仙［6］、石蒜［7］、桂花［8］、文心兰［9］等花卉植物的花梗经诱导均可形成愈伤组织，而洋葱的小花梗多且易取，消毒方便、污染率低。因此，本试验选取8个洋葱品种，用其花梗进行愈伤组织诱导及再生研究，以期为构建洋葱遗传转化体系和基因编辑技术研究奠定基础。

2012年8月31日第十一届全国人民代表大会常务委员会第二十八次会议通过了《关于修改〈中华人民共和国民事诉讼法〉的决定》，该修改决定首次在简易程序章节中以法律形式规定了我国的民事小额诉讼制度，其意义极为重大。然而，因为立法对小额诉讼制度只作了简单的规定，所以导致不同人对小额诉讼有不同的解读，小额诉讼制度的多义性在学理上有其合理性，但在实践中却不利于其统一实施。基于此，本文拟通过对小额诉讼程序性质的解读，为小额诉讼制度的具体规范提供一些前提性的资源。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验选用中日照洋葱品种（表1），均种植于连云港市农业科学院东辛试验基地。于洋葱先期抽薹时取未开裂花苞，装入密封袋中4℃保存备用。

表1 供试洋葱品种详细信息

1.2 花梗愈伤组织诱导

医院要完善新医改下的精细化管理工作，就需要有力的财经管理部门作为支撑，按照《医院财务制度》，实施全面预算管理，着力成本控制，有效防范风险，达成综合绩效目标，使财务工作实现闭环式管理。通过建立管理会计制度，促进医院财务精细化，科学化管理，优化流程，提升组织效率。但是，在这个阶段，医院财务人员的整体规模不足。这表明在推进管理会计的过程中，管理型人才实力就更加紧缺。

1.3 愈伤组织继代培养及再生苗诱导

将诱导出的洋葱苗在再生培养基（MS＋30 g／L蔗糖＋8 g／L琼脂）中生根，待基部鳞茎达0.5 cm，于4℃放置24 h。用清水清洗根部培养基（根部不离水）后移栽到花盆中，室内（散射光照射）放置3 d后移至室外生长，期间防止阳光直射。

1.4 驯化移栽

将诱导得到的愈伤组织继代培养基（MS＋1.8 mg／L 2，4-D ＋30 g／L蔗糖＋8 g／L琼脂）培养4周后转接至无激素的培养基（MS＋30 g／L蔗糖＋8 g／L琼脂）上，每品种转接80瓶，每瓶5个愈伤。在光照强度为50μmol／（m2·s）、光周期16 h／d、25℃条件下培养120 d后，统计再生芽的数量，计算再生频率。再生频率＝再生苗数量／愈伤组织总数。

将花苞用自来水冲洗10 min，去除最外层花苞，同时去除花朵，只留花梗。用75%酒精浸泡花梗30 s，无菌水冲洗两次，2%次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗两次，后用无菌滤纸吸干多余水分。将花梗切碎放入盛有25 mL诱导培养基（MS＋1.8 mg／L 2，4-D＋2.0 mg／L甘氨酸＋700 mg／L脯氨酸＋1.0 g／L干酪素水解物＋30 g／L蔗糖＋8 g／L琼脂）的培养皿（直径为9 cm）中，每品种接种20皿，置于黑暗、25℃下培养。

2 结果与分析

2.1 洋葱花梗愈伤组织诱导分析

切碎的花梗培养3～4 d后，两端开始形成愈伤组织并逐步生长变大，颜色呈淡黄色（图1A）。待其长至米粒大小时转入新培养基中进行继代培养，8个品种不受基因型影响，均能诱导出愈伤组织，诱导率为100%（图1B）。

2.2 洋葱愈伤组织再生苗诱导分析

由表2可以看出，8个品种中1803再生频率最高，达30%，其它品种不足10%；1833、1864和1868的愈伤组织未诱导成苗，呈白灰色、发软，未见新根诱导及生长迹象。因此，洋葱再生频率与愈伤组织外植体基因型有关。

经诱导，洋葱愈伤组织开始生根，但不同品种间生根快慢和多少存在差异。培养60 d后，大部分愈伤组织呈干枯状（图2A、2B）；较大的愈伤组织上绿色原基开始突出，慢慢长出畸形管状叶（图2B、2C），随后萌发出多个管状叶，形成植株（图2D）。洋葱苗于鳞茎基部生根，长苗和生根同步进行，长出的根比原愈伤组织的粗壮、长且长速快（图2E、2F）。

表2 洋葱愈伤组织再生苗数统计

2.3 洋葱愈伤组织再生苗移栽结果

诱导洋葱苗移栽后的生长情况如图3所示，移栽成活率为90%。但叶片过细和数量少时不宜移栽，可在组培瓶中多生长一段时间。

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3 讨论与结论

目前，国内外少有采用洋葱花梗作为外植体进行愈伤组织诱导的报道，大部分研究集中于种子、成熟胚、茎尖等外植体，而在园艺花卉植物中利用花梗进行愈伤诱导较为普遍。钟瑞洁［10］对‘新发中秋花’萱草进行组织培养研究发现，其幼嫩花梗分蘖结节处为最适宜外植体。张梦迪［11］以朱顶红‘Blossom Peacock’和‘Royal Velvet’花梗为外植体进行试验，发现其在光照、培养基为MS＋0.5 mg／L萘乙酸（NAA）＋2.0 mg／L噻苯隆（TDZ）上的愈伤诱导率分别达到37.50%、29.17%。陈菁珏［12］认为花梗是石蒜花愈伤诱导的最佳外植体。张杰等［13］也认为百合花器官中花丝易诱导形成愈伤组织，花梗易诱导成不定芽。基于此，本研究对8个洋葱品种花梗进行愈伤诱导，发现其均能形成愈伤组织，诱导率高达100%。花梗为果实或种子提供营养的必经通道，运输营养物质和代谢激素，尤其是离体培养后相关基因调控激素代谢表达。Fu等［14］对番茄花梗脱落过程的研究发现，水解植物生长素结合物调节生长素浓度，SlILR1、5、6基因在花梗脱落中起关键作用。本试验认为，将花梗放入培养基中培养，较长的花梗会在培养基中继续生长，且花梗中存在调控生长相关激素，能够促进愈伤萌发。

本研究中8个品种均能100%诱导形成愈伤组织，但3个品种未诱导成苗，仅1803品种再生频率最高，为30%，其它4个品种的再生频率非常低。本团队前期研究发现，洋葱其它外植体也能经诱导形成愈伤，但在各种激素或无激素培养基上均未诱导成苗，且45 d后愈伤组织开始干枯、由淡黄变灰白色，50 d后枯死。本研究中愈伤组织生长较慢，因放假等原因超50 d未继代处理，60 d后开始有绿色原基出现，2～3个月才有洋葱苗长出，120 d后未诱导成苗的愈伤组织发软或表面干枯。

研究发现，洋葱胚芽（茎尖）诱导形成的愈伤组织在MS＋1.5 mg／L 6-BA＋2 mg／L甘氨酸和MS＋1 mg／L TDZ＋0.5 mg／L NAA＋7.5 mg／L AgNO3培 养基 上 再 生 频 率 分 别 达78%［15］、82%［16］，在MS＋30 g／L蔗糖和BDS（改良B5培养基）＋30 g／L蔗糖培养基上再生频率分别达到44%和80%［17，18］。本研究中洋葱花梗愈伤组织在无激素培养基上能够诱导再生苗，再生频率为30%。另有研究发现，低温处理改变水稻花药壁的多糖和蛋白质组成，并增加花粉的繁殖力和愈伤组织的诱导率；低温预培养提高了雪莲愈伤组织的存活率和再生能力［19，20］。洋葱苗生长发芽以及春化均需要较低的温度，低温可能会促进其愈伤再生频率，下一步将研究低温处理是否有利于洋葱再生频率的提高。